新型多粘菌素的抑菌机制及海洋细菌NH1T分类及耐药性的研究

摘要

细菌感染引起的各类疾病一直被认为是世界各国公共卫生所面临的主要威胁和挑战。在过去的十年里，抗生素的大量使用导致了越来越多的耐药性细菌的出现，这对人类的健康造成了严重的威胁。因此对新型抗生素及细菌的耐药机制的研究有着十分重要的意义。本论文以一种新型的多粘菌素对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌的抗菌活性作为研究对象，利用转录组学的方法对新型多粘菌素FADDI-019抑制革兰氏阳性菌的机制进行探究。其中该抗生素敏感性试验表明，尽管万古霉素耐药性金黄色葡萄球菌对多粘菌素B、E有耐受性，但是两株菌对多粘菌素衍生物FADDI-019均增加了敏感性，并且24小时后未检测出任何再生长现象;扫描电镜的结果表明FADDI-019对VRSA的作用不是直接通过膜损伤造成的，这也暗示了其靶点是在细胞内部;转录组数据表明经过FADDI-019作用后，共有208个基因差异性表达，其中有140个基因表达上调，这其中包括了万古霉素耐药调节因子、氨基酸、能量及叶酸代谢相关的基因;68个基因表达下调，它们分别是与VRSA ATCC700699关键毒力因子相关的基因，这表明FADDI-019除了可以杀灭VRSA ATCC700699,也可以减少其感染时的毒力;代谢通路分析表明四氢叶酸产物的合成途径可以作为抑制对其有依赖的叶酸代谢及氨基酸代谢这两个过程的阻塞点;最后我们通过对叶酸代谢节点的鉴定对磺胺甲恶唑与FADDI-019联合用药进行测试，该组合表现出了协同效果，为目前存在的比单一用药有更强抗菌效果的联合用药提供了新的选择。
　　本论文还对一株分离于自然环境中的海洋细菌NH1T进行了抗生素敏感性及与耐药性相关的生物信息学研究。抗生素敏感性试验表明该菌对除了氟奎诺酮类抗生素之外的所有测试过的抗生素均不敏感，表现出较强的耐药性;基因组信息表明NH1T总序列长度为6,131,579bp，其中G+C％为41.94％，共有5908个开放阅读框;耐药基因分析预测出10个匹配严格的耐药基因，并将比对结果按照耐药基因直系同源（ARO）分类比对得到了许多抗生素耐药基因、与耐药性相关的外排泵基因及抗生素靶点修饰酶基因。
　　除了对新型多粘菌素对VRSA抑菌机制及海洋细菌NH1T耐药性的研究之外，本论文还对在分离海洋环境中耐药菌试验中得到的两株海洋新细菌进行其多相分类学的研究，实验结果表明FA028T为交替单胞菌科的新属新种，命名为底泥海碱菌(Alkalimarinus sediminis gen.nov.sp.nov.)，模式菌株为FA028T(=CICC10906T=KCTC42258T);菌株NH1T可以确定为食冷菌属的新种，命名为耐药食冷菌(Algoriphagus resistens sp.nov.)模式菌株为NH1T(=KCTC42258T)。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 绪论

1．1 多粘菌素

1．1．1 多粘菌素的结构

1．1．2 多粘菌素的抗茵机制

1．1．3 多粘菌素的耐药性机制

1．2 万古霉素耐药性金黄色葡萄球菌

1．2．1 金黄色葡萄球菌

1．2．2 抗生素治疗及耐药性的产生

1．3 耐药基因的水平转移

1．3．1 质粒

1．3．2 转座子

1．3．3 整合子

1．3．4 基因突变型

1．4 新型抗生素研制及协同联合用药

1．4．1 新型抗生素

1．4．2 协同联合用药

1．5 立项依据

第二章 新型多粘菌素FADDI-019对多重耐药的金黄色葡萄球菌的抑菌活性及转录组学的研究

2．1 实验材料和仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验菌株

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 抗生素敏感性测定

2．2．2 杀菌效力评估试验

2．2．3 RNA-Seq转录组测序

2．2．4 SEM形态学研究

2．2．5 生物信息学分析

2．3 实验结果及分析

2．3．1 FADDI-019的抗菌活性

2．3．2 FADDI-019杀菌效力研究

2．3．3 SEM形态学研究

2．3．4 转录组学研究

2．3．5 FADDI-019对万古霉素耐药调节因子的影响

2．3．6 氨基酸，能量和叶酸代谢相关的基因分析

2．3．7 VRSA ATCC 700699关键毒力因子的抑制

2．3．8 叶酸代谢节点的鉴定

2．4 讨论

2．5 本章小结

第三章 海洋耐药菌NH1T耐药谱及耐药机制的研究

3．1 实验材料和仪器

3．1．1 培养基及相关溶液

3．1．2 主要试剂

3．1．3 实验菌株

3．1．4 相关数据库及软件

3．1．5 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 菌株的分离

3．2．2 菌株抗生素敏感性测定

3．2．3 NHlT的基因组测序

3．2．4 基于NHlT的基因组序列的生物信息学分析

3．3 实验结果及分析

3．3．1 耐药菌的分离

3．3．2 NH1T及5株食冷菌属菌株抗生素敏感性

3．3．3 NH1T的基因组信息

3．3．4 NH1T耐药基因预测

3．3．5 食冷菌属耐药基因预测

3．4 本章小结

第四章 两株海洋新菌的鉴定

4．1 实验材料和仪器

4．1．1 培养基及相关溶液

4．1．2 实验菌株

4．1．3 主要试剂

4．1．4 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 菌株的分离

4．2．2 菌株的表型鉴定

4．2．3 菌株生理生化鉴定

4．2．4 化学组分分析

4．2．5 菌株G+C％含量的测定、16sr RNA序列的获取及系统发育分析

4．3 实验结果及分析

4．3．1 底泥海碱菌(Alkalimarinus sediminis gen．nov．sp．nov．)FA028T的鉴定

4．3．2 耐药食冷菌(Algoriphagus sp．nov．)NH1T的鉴定

4．4 本章小结

总结和展望

参考文献

致谢

资助情况

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附录