Cytophaga hutchinsonii中纤维素降解相关突变株的筛选及chu_0602的研究

摘要

随着社会的发展，人们认识到能源枯竭和环境污染等问题给人类社会带来了巨大的挑战，在这种形势下可再生绿色能源的开发和利用技术就成了应对挑战的有效方法。绿色植物产生的木质纤维素被认为是地球上最丰富的可再生资源之一，其开发和利用有着广阔的应用前景。由于植物的自我保护进化，自然条件下纤维素自身存在着致密的结晶区域，使得现有的技术手段很难像利用纤维素的微生物那样高效的降解纤维素，因此研究自然条件下微生物利用纤维素的机制非常必要。
　　哈氏噬纤维菌（cytophaga hutchindonii，C.hut）是一种在自然界中有着广泛分布的好氧革兰氏阴性菌，它属于拟杆菌门（Bacteroidetes），其有着与已知能降解纤维素的微生物都不相同的纤维素降解机制，具有极强降解结晶纤维素能力。哈氏噬纤维菌不依赖于鞭毛或纤毛却能在湿润的琼脂表面和玻璃片表面迅速地运动;哈氏噬纤维菌能够快速高效的降解纤维素的结晶区，但是哈氏噬纤维菌不向胞外分泌游离的纤维素酶，它也没有明显的纤维素酶复合体结构，所以其降解纤维素的机制和运动机制目前都不清楚。在降解纤维素晶体时，哈氏噬纤维菌会有序的排列在其上，因此有报道认为哈氏噬纤维菌的运动有助于它的纤维素的降解，并且这有可能是一种新的纤维素降解机制。
　　为了得到与纤维素降解相关的基因，我们采用了转座子随机插入突变的方法来进行人为的诱变。转座子插入突变实验采用的是Tn4351转座子，其相比较于实验室曾经使用的HimarEm3转座子Tn4351转座子在菌体基因组中很多为多插入位点，因此突变来源更为广泛。把Tn4351转座子通过电转化的方式转入到C.hut的菌体中，转座子会以随机插入的方式整合到细菌的基因组上，影响细菌的表型。通过在双层纤维素验证平板上接种转化子，根据转化子在平板上水解纤维素的情况，筛选出与纤维素降解相关的菌株。然后通过分子水平对突变株鉴定，找到转座子插入基因的位点。由于其已经在2007年进行了全基因的测序，结合生物信息学综合判断确定有价值基因进一步的研究。我们挑取了大约11000个转化子在纤维素双层平板上，筛选到约180个有明显表型的菌株，最终选取了36个特殊表型的菌株做了分子学鉴定，在不同的菌株中共得到了个36基因的插入位点（有些基因被重复筛选到），其中包括之前报道的chu_0134,chu_0170，chu_1075,chu_1798等重要基因，它们都严重影响了细菌的生长和纤维素降解。由于Tn4351转化子在基因组上多为多插入，这样的好处是能得到更多的插入位点，但在多插入的转化子中不能确定哪一个或者哪几个基因的改变最终导致了表型的改变，因此对于多插入转化子需要对单个基因逐一敲除研究。对筛选的到的基因做了综合分析，除去了曾经报道过的重要基因，我们先后对一些基因进行了双交换单独敲除实验。
　　在筛选突变株表型的过程中我们注意到除去已经报道过的几个重要基因和一个色素基因缺失的突变株，chu_0602基因缺失的突变株是表型最为明显突变株之一，其降解纤维素的能力大大下降，之后双交换敲除工作又成功敲除了chu_0602基因，发现二者的表型一致，这证明了chu_0602的缺失影响了纤维素的降解。NCBI标注显示:chu_0602基因编码的是一个脂质A核心-O-抗原连接酶(lipid A core-O-antigen ligase，Wzy_C)，推测其在脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)合成的过程中起到了关键的作用，chu_0602的缺失导致脂多糖部分缺失，进而对生长、纤维素降解、运动以及抗性等的产生多重影响。chu_0602缺失菌株在Stanier纤维素固体培养基和Stanier滤纸培上的纤维素降解能力显著下降。在软琼脂和硬琼脂上突变株都表现出运动能力的下降。通过光学和扫描电子显微镜(SEM)观察突变株的菌体，发现明显长于野生型菌株，尤其是在延滞期到指数前期这种现象更为明显。突变株在滤纸上的排布比野生型菌株混乱，而且突变株的菌体表面更为光滑。生长曲线测量结果显示突变株以Avicel为碳源比以葡萄糖为碳源时延滞期增长，生长速率下降。我们检测了在不同的碳源培养条件下内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活力的分布情况，发现了脂多糖缺失影响内切纤维素酶分布的新现象，脂多糖缺失而对β-葡萄糖苷酶活力的分布没有明显影响。在以葡萄糖为唯一碳源时，与野生株相比突变株细胞表面内切纤维素酶活明显下降，表面酶活占全细胞酶活的比例也明显下降，而胞内的纤维素酶活水平和野生株基本相当。推测可能由于外膜脂多糖的缺失，影响了纤维素酶在细胞表面的锚定。当以Avicel为唯一碳源时，纤维素酶被大量诱导。突变株和野生株相比菌体表面的纤维素酶酶活与野生株基本一致，但是表面纤维素酶占全细胞酶活的比例大大下降。与野生株相比，突变株胞外出现大量纤维素酶累积。推测可能由于外膜脂多糖的缺失影响了纤维素酶在细胞表面的锚定，从而释放到细胞外环境中。说明脂多糖与细胞表面纤维素酶的锚定密切相关。我们还进行了突变株抗逆性实验，发现突变株在外界环境压力（SDS、抗生素、H2O2、结晶紫等）下抗性比野生型菌株下降。SDS-PAGE电泳结果显示chu_0602突变株外膜蛋白、外膜纤维素吸附蛋白和胞外分泌蛋白跟野生型菌株相比都有较大变化，其中外膜蛋白和外膜纤维素吸附蛋白总量明显减少，而胞外蛋白总量显著增加。我们对变化明显的外膜蛋白进行了质谱分析，外膜缺失的蛋白有很多跟纤维素的吸附和菌体的运动相关。推测由于LPS的部分缺失影响了细胞外膜的完整性，导致部分外膜蛋白释放到胞外，从而影响了细菌纤维素降解等能力。

目录

声明

摘要

缩写词表

第一章 绪论

1．1 纤维素资源的前景

1．2 纤维素的分子结构

1．3 降解纤维素的微生物

1．3．1 纤维素降解真菌

1．3．2 纤维素降解细菌

1．4 微生物降解纤维素的策略

1．4．1 游离纤维素酶系协同降解纤维素机制

1．4．2 纤维小体降解纤维素机制

1．4．3 细胞结合型非复合体纤维素降解机制

1．4．4 纤维素氧化降解机制

1．5 细菌LPS的介绍

1．5．1 脂多糖的结构

1．5．2 脂多糖的合成

1．5．3 脂质A核心-O-抗原连接酶

1．6 哈氏噬纤维菌背景及研究进展

1．6．1 哈氏噬纤维菌的特征及系统发生

1．6．2 哈氏噬纤维菌对纤维素的吸附

1．6．3 哈氏噬纤维菌的运动

1．6．4 哈氏噬纤维菌中的T9SS分泌系统

1．7 哈氏噬纤维菌的研究进展

1．8 论文选题来源和工作思路

第二章 Tn4351转座子在Cytophaga hutchinsonii中插入突变筛选菌株以及部分基因的缺陷菌株的构建

2．1 材料与方法

2．1．1 菌种

2．1．2 质粒与引物

2．1．3 培养基和抗生素溶液的配制

2．1．4 试剂与仪器

2．1．5 实验方法

2．2 实验结果

2．2．1 筛选到的突变株

2．2．2 反向PCR

2．2．3 部分基因缺陷菌株的构建

2．3 讨论

第三章 chu_0602基因功能的研究

3．1 材料与方法

3．1．1 菌种

3．1．2 质粒和引物

3．1．3 培养基和抗生素溶及缓冲液的配制

3．1．4 试剂与仪器

3．1．5 实验方法

3．2 实验结果

3．2．1 生物信息学分析

3．2．2 双层纤维素平板和滤纸平板降解实验

3．2．3 软琼脂和硬琼脂扩散实验

3．2．4 光学显微镜和扫描电子显微镜对chu_0602突变株的观察

3．2．5 chu_0602突变株的菌体颜色分析

3．2．6 chu_0602突变株的生物膜

3．2．7 chu_0602突变株的三种底物生长曲线的测定

3．2．8 chu_0602突变株三种培养底物的酶活的测定

3．2．9 chu_0602突变株的蛋白提取、SDS-PAGE和质谱分析

3．2．10 chu_0602突变株的吸附率的测定

3．2．11 chu_0602突变株多糖的研究

3．2．12 chu_0602突变株的抗性实验

3．2．13 chu_0602回补菌株的研究

3．2．14 chu_0603基因的初步研究

3．3 讨论

全文总结与展望

参考文献

致谢