阿尔茨海默病中内质网应激介导胰岛素信号通路功能障碍及其机制的研究

摘要

目的:
　　1、验证在AD细胞模型及AD转基因动物模型中是否存在ERS及胰岛素信号通路功能障碍。
　　2、明确在AD细胞模型及AD转基因动物模型中ERS是否可引起胰岛素信号通路功能障碍。
　　3、探讨在AD细胞模型及AD转基因动物模型中ERS引起胰岛素信号通路功能障碍的机制。
　　方法:
　　1、体外实验:
　　高分化大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）培养:
　　购自中国科学院细胞库（目录号:TCR9），置于37℃、含有5％ CO2的细胞培养箱中，使用添加10％胎牛血清以及100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的高糖DMEM培养。按照实验需求对细胞进行复苏、传代、冻存、干预处理及蛋白收集等操作。
　　皮层原代神经元培养及鉴定:
　　取新生1天内Wistar大鼠乳鼠（购于山东大学实验动物中心）皮层组织，按照步骤分离神经元，置于37℃、含有5％CO2的细胞培养箱中，使用添加有2％无血清B27、0.5％L-谷氨酰胺以及100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的Neurobasal A培养基培养。培养10天的皮层原代神经元用于实验。采用MAP2及GFAP免疫荧光染色方法对神经元进行鉴定。
　　2、体内实验:
　　AD转基因小鼠饲养及鉴定:
　　AD转基因小鼠及相应野生型(Wild type，WT)小鼠购自南京大学南京模式动物研究中心（来源自Jackson实验室）。AD转基因小鼠品系名称为B6C3-Tg(APPswe，PSEN1dE9)85Dbo/Mm JNju，简称APP/PS1。饲养室环境温度控制在22±3℃，相对湿度60％，光线自动控制，明(07:00-19:00)暗(19:00-07:00)交替。小鼠饲养按照SPF动物饲养规范进行。繁殖后代小鼠在1月时取鼠尾尖DNA进行基因型鉴定。9月龄APP/PS1转基因小鼠进行Aβ免疫组化染色证实皮层有大量Aβ沉积，并有明显水迷宫行为学改变，符合实验需要。
　　APP/PS1及WT小鼠行为学检测:
　　采用Morris水迷宫对不同干预的WT及APP/PS1小鼠进行行为学检测。全过程包含1天适应期（没有平台），连续5天进行的定位航行实验和1天空间探索实验。
　　3、Aβ1-42寡聚体的制备与鉴定:
　　制备主要按照Rochester医学中心的William J.Bowers教授的方法进行。Aβ1-42寡聚体制备后，采用透射电镜进行鉴定，确定寡聚体形成后保存于-80℃。使用时采用无血清培养基稀释至合适浓度。
　　采用CCK-8检测不同处理条件导致的细胞毒性。
　　4、蛋白表达及磷酸化改变的检测:
　　采用western blotting检测不同处理条件下PC12细胞、原代神经元、WT及APP/PS1小鼠蛋白表达及磷酸化改变。包括:①内质网标志物:BiP，CHOP;②JNK激活:t-JNK，p-JNK Thr183/Tyr185;③胰岛素信号通路功重要分子:t-IRS-1，p-IRS-1 Ser307，p-IRS-1 Ser318，p-IRS-1 Ser612，t-Akt，p-Akt Ser473;④AD病理改变:t-Tau，p-Tau Thr181。
　　5、ERS相关基因mRNA水平的改变:
　　采用实时荧光定量PCR检测不同处理条件下PC12细胞内质网相关基因mRNA水平改变，包括:BiP、CHOP、ATF4、GADD34、Nrf2、PUMA、TRB3XBP1s/XBP1u。采用RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳检测XBP1剪切。
　　6、统计分析:
　　定量数据采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，取p值小于0.05为具有统计学差异。使用SPSS17.0进行统计分析。
　　结果:
　　1、Aβ1-42寡聚体增加PC12细胞IRS-1丝氨酸磷酸化
　　为检测胰岛素信号通路功能状态，需要使用基础水平胰岛素刺激，首先进行胰岛素浓度梯度实验。PC12细胞经不同浓度的胰岛素(0，25，50，100以及200nM)处理30 min后，p-IRS-1Ser307、p-IRS-1 Ser318及p-IRS-1 Ser612位点丝氨酸磷酸化呈现浓度依赖性升高。在25 nM胰岛素作用30 min后，p-Akt Ser473磷酸化升高，与空白对照组相比有统计学意义(p＜0.05)，而p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318及p-IRS-1 Ser612并未显著升高。因此，在后续实验中我们选择了25nM作为PC12细胞基础胰岛素浓度。参考既往研究，原代神经元的基础胰岛素浓度为1nM。
　　为选择合适的Aβ1-42寡聚体处理条件，进行Aβ1-42寡聚体浓度梯度及时间梯度实验。PC12细胞经不同浓度Aβ1-42寡聚体(0，0.25，0.5，0.75，1以及2μM，处理时间为120 min)及不同时间(0，15，30，60，120以及240 min，处理浓度为1μM)处理后（在收蛋白之前30 min添加浓度为25 nM胰岛素刺激），p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318及p-IRS-1 Ser612位点丝氨酸磷酸化呈现剂量依赖性以及时间相关性升高。Aβ1-42寡聚体处理(1μM，120 min)可显著升高p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平(p＜0.05)，降低p-AktSer473磷酸化水平(p＜0.05）。因此，在后续实验中，以1μM和120 min作为Aβ1-42寡聚体处理PC12细胞的条件参数。参考既往研究，Aβ1-42寡聚体处理原代神经元的条件为500 nM及3h。
　　2、Aβ1-42寡聚体、TG处理可诱发ERS，引起JNK激活并升高IRS-1丝氨酸磷酸化水平
　　在PC12细胞中，A31-42寡聚体(1μM，120 min)处理可以引起BiP、CHOP蛋白水平升高(p＜0.05)，BiP、CHOP、ATF4、TRB3、PUMA、GADD34、Nrf-2mRNA水平升高(p＜0.05），以及XBP1的剪切。Aβ1-42寡聚体(1μM，120 min)及ERS诱导剂TG(2μM，120 min)可引起p-JNK Thr183/Tyr185磷酸化水平升高(p＜0.05)以及p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318和p-IRS-1Ser612磷酸化水平升高(p＜0.05)。Aβ1-42寡聚体(1μM，24 h)及TG（2μM，24h）可引起p-Tau Thr181磷酸化水平升高(p＜0.05)。
　　3、APP/PS1小鼠皮层存在ERS、JNK激活及IRS-1丝氨酸磷酸化水平的升高
　　9月龄雄性APP/PS1转基因小鼠与同月龄同窝雄性WT小鼠相比，皮层BiP及CHOP表达升高(p＜0.05)，p-JNK Thr183/Tyr185、p-IRS-I Ser307、p-IRS-1 Ser318以及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平升高(p＜0.05)。
　　4、抑制ERS可降低Aβ1-42寡聚体引起的JNK激活、IRS-1丝氨酸磷酸化
　　在皮层原代神经元以及PC12细胞中，ERS抑制剂PBA预处理(2mM，3h)可降低Aβ1-42寡聚体处理引起的p-JNK Thr183/Tyr185、p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1Ser318、p-IRS-1 Ser612以及p-Tau Thr181磷酸化(p＜0.05)。给予APP/PS1转基因小鼠腹腔注射PBA(200 mg/kg，5周)可改善水迷宫行为学表现，并降低皮层p-JNKThr183/Tyr185、p-IRS-1Ser307、p-IRS-1Ser318以及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平(p＜0.05)。
　　5、抑制JNK激活可降低Aβ1-42寡聚体引起的IRS-1丝氨酸磷酸化
　　在皮层原代神经元以及PC12细胞中，JNK抑制剂SP600125预处理(25μM，40 min)可降低p-JNKThr183/Tyr185、p-IRS-1Ser307、p-IRS-1Ser318、p-IRS-1 Ser612以及p-Tau Thr181磷酸化(p＜0.05)。给予APP/PS1转基因小鼠腹腔注射SP600125（30 mg/kg，12周）可改善水迷宫行为学表现，并降低皮层p-JNK Thr183/Tyr185、p-IRS-1Ser307、p-IRS-1 Ser318以及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平(p＜0.05)。
　　结论:
　　1、在Aβ1-42寡聚体处理的PC12细胞、皮层原代神经元，APP/PS1小鼠中存在ERS及胰岛素信号通路功能障碍。
　　2、在Aβ1-42寡聚体处理的PC12细胞、皮层原代神经元，APP/PS1小鼠中ERS可引起胰岛素信号通路功能障碍。
　　3、在Aβ1-42寡聚体处理的PC12细胞、皮层原代神经元，APP/PS1小鼠中，ERS引起胰岛素信号通路功能障碍的可能机制为JNK依赖性的IRS-1丝氨酸磷酸化。
　　4、在Aβ1-42寡聚体处理的PC12细胞、皮层原代神经元中，ERS/JNK/IRS-1通路的激活可引起Tau蛋白过磷酸化。

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