丙泊酚与七氟烷对缺血再灌注损伤的保护作用的机制研究

摘要

本项目拟研究miRNA-17在丙泊酚调控血管内皮细胞保护作用中的分子机制;同时构建肝脏缺血再灌注大鼠模型，探讨丙泊酚和七氟烷是否对肝脏缺血再灌注具有保护作用及其具体的作用机制。
　　第一部分 丙泊酚通过调控miR-17激活STAT3信号通路抑制人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤
　　目的：
　　研究miRNA-17在丙泊酚诱导的血管内皮细胞保护作用中的分子机制。
　　方法：
　　1.体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，构建缺氧复氧的细胞模型;根据处理因素的不同，分为H/R组，H/R+propofol150μmol/L组，H/R+miR-17inhibitor组，H/R+miR-17 scramble组(NC);
　　2.利用Real-time PCR技术检测丙泊酚对血管内皮细胞中miR-17表达水平的影响;
　　3.利用CCK-8实验检测丙泊酚对HUVECs保护作用;
　　4.利用Annexin-Ⅴ/PI双染法及流式细胞术证实miR-17抑制剂对凋亡的抑制作用;
　　5.利用Western blot检测丙泊酚处理和miR-17表达后Bax和Bcl-2的变化;
　　6.利用Western blot检测miR-17对STAT3表达的影响，利用Western blot分析miR-17模拟物转染后STAT3蛋白的变化;
　　7.通过双荧光素酶报告实验鉴定miR-17与STAT3 mRNA的结合。
　　结果：
　　1.Real-time PCR分析发现，HUVECs和H/R HUVECs中的miR-17表达无明显改变。但是，经丙泊酚处理后，正常细胞和H/R细胞中的miR-17表达均显著下降。这些结果表明，miR-17对H/R导致的血管内皮细胞损伤可能具有保护作用;
　　2.CCK-8试验表明，H/R处理之后，丙泊酚处理使细胞活力显著上调，转染miR-17抑制剂使H/R处理之后的细胞活力上调。这些结果表明，给予丙泊酚对HUVECs有H/R保护作用，而且该保护作用可能依赖于miR-17的表达调控;
　　3.Annexin-Ⅴ/PI双染法及流式细胞术证实miR-17抑制剂对细胞凋亡的抑制作用，使用miR-17抑制剂或阴性对照（scramble对照）质粒转染了HUVECs，并用AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶染色，然后在H/R处理之后采用流式细胞术进行分析。与未经H/R处理组相比，给予丙泊酚后的凋亡细胞数量明显减少。与转染scramble对照质粒的细胞相比，转染miR-17抑制剂的细胞中凋亡细胞的数量也发生类似的减少;
　　4.Western blot测定了凋亡相关蛋白，H/R处理之后给予丙泊酚处理时，凋亡蛋白Bax发生显著下调，而抗凋亡蛋白Bcl-2发生上调。此外，缺氧处理后进行miR-17抑制剂转染时，这些蛋白质具有相同的表达趋势;
　　5.STAT3活化可引起细胞周期控制调节异常以及凋亡基因异常表达，从而导致细胞凋亡。因此，miR-17可能通过靶向作用于STAT3而抑制内皮细胞凋亡。为了明确miR-17是否可以直接靶向作用于HUVECs中的STAT3，进行了Western blot分析，发现miR-17模拟物转染后STAT3蛋白的表达显著下调;
　　6.将STAT3的3'-UTR克隆到pMIR-REPOR荧光素酶对照载体。然后制备突变的报告基因，使其STAT33'-UTR中的miR-17种子匹配序列发生突变。该STAT33'-UTR和miR-17共转染使相对荧光素酶活性显著下降。相反，与NC相比，突变STAT33'-UTR不受miR-17过表达的影响。这些数据表明，STAT3 mRNA和miR-17之间存在直接的相互作用。
　　结论：
　　丙泊酚能够改善缺氧复氧后脐静脉内皮细胞的血管内皮损伤，这个保护作用的机制之一可能是miR-17下调介导的STAT3信号通路激活。
　　第二部分 丙泊酚和七氟烷两种麻醉药对肝脏缺血/再灌注损伤的作用
　　目的：
　　探讨并比较丙泊酚和七氟烷对肝脏缺血/再灌注的作用及其确切的分子机制。
　　方法：
　　1.选用雄性SD大鼠，建立肝脏缺血再灌注的模型;
　　2.采集肝脏组织，10％福尔马林固定24小时以上，包埋后制作4μm厚度切片，然后进行HE染色，在光镜下进行组织病理学检查，评估炎症和组织损伤情况;
　　3.使用生化分析仪检测大鼠血清中的血清ALT、AST和LDH的水平，验证丙泊酚和七氟烷对这三种酶的作用;
　　4.利用联免疫吸附试验检测大鼠血清中炎性介质（TNF-α，、IL-1、IL-10和IL-6）的浓度和水平，以明确丙泊酚和七氟烷是否可以降低这些细胞因子的水平;
　　5.利用qRT-PCR技术检测TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10等炎性细胞因子mRNA的表达，进一步明确丙泊酚和七氟烷对这些细胞因子的水平的作用;
　　6.利用Western blot检测了NF-κB的水平，观察炎性细胞因子释放是否受NF-κB调控;
　　7.利用特定检测试剂盒评估大鼠肝组织中氧化应激生物标志物MDA和NO以及抗氧化标志物SOD的水平;
　　8.利用TUNEL法检测肝组织细胞凋亡情况;
　　9.利用Western blot检测丙泊酚和七氟烷对Bcl-2家族、AKT和p38-MAPK信号通路的影响，探究丙泊酚和七氟烷的抗凋亡机制;
　　10.利用行免疫组化染色检测丙泊酚和七氟烷对肝脏I/R损伤大鼠的p-Akt和p-p38表达的影响。
　　结果：
　　1.肝组织损伤的组织学评估使用HE染色进行。Suzuki评分显示IR组的病理改变为IR诱导的重度损伤;类似地，丙泊酚和七氟烷降低了Suzuki评分，即减轻了损伤程度;
　　2.血清中释放的几种标志物评估肝脏损伤，包括AST、ALT和LDH，I/R组中这些酶的水平明显升高，但是丙泊酚和七氟烷均使这三种酶的漏出减少;
　　3.TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10等炎性因子在肝脏I/R损伤的病理生理中发挥关键作用。为了明确丙泊酚和七氟烷是否可以降低这些细胞因子的水平，使用ELISA和qRT-PCR分别测定了它们在肝组织中的水平和mRNA表达。丙泊酚和七氟烷均使TNF-α、IL-1和IL-6的释放以及mRNA表达降低，并增加了IL-10的水平。但是，丙泊酚组的IL-1释放显著低于七氟烷组，而TNF-α释放显著高于七氟烷组;
　　4.Western blot检测了NF-κB的表达，观察炎性细胞因子的释放是否受NF-κB调控。I/R诱导的P65磷酸化水平升高受到丙泊酚和七氟烷处理的抑制。相反，丙泊酚和七氟烷上调了IκBα的表达。丙泊酚对NF-κB表达呈现出更强的抑制作用;
　　5.测定了MDA、SOD和NO的水平，以评估丙泊酚和七氟烷对氧化应激的影响。MDA和NO的水平于缺血再灌注时显著增加，而丙泊酚和七氟烷处理可使其恢复。与I/R组相比，丙泊酚和七氟烷处理组的SOD水平下降;
　　6.TUNEL法检测显示I/R组的凋亡率显著增加，而丙泊酚和七氟烷均使凋亡减轻;
　　7.Western blot实验证实:丙泊酚和七氟烷可抑制缺血性肝损伤中Bcl-2和Bcl-xl等抗凋亡蛋白的下调，而降低Bak和Bax等促凋亡蛋白的上调，最终使诱导肝组织凋亡的细胞色素C和caspase蛋白表达下调;
　　8.Western blot实验证实:丙泊酚增强了AKT的磷酸化而抑制了BAD的磷酸化。七氟烷显著降低了肝脏缺血再灌注诱导的p38磷酸化，而AKT和BAD的总表达或磷酸化未发现改变;
　　9.免疫组化显示丙泊酚增加了AKT磷酸化，而七氟烷抑制了p38的磷酸化。
　　结论及意义：
　　丙泊酚和七氟烷均可通过调节多种重要的病理生理过程，如细胞因子释放的改变、伴ROS生成改变的氧化应激以及凋亡，而对肝脏缺血/再灌注损伤发挥保护作用。这些过程相互关联，为保护作用的确切机制提供了线索。该领域仍需进一步研究，从而为丙泊酚和七氟烷的临床使用提供必要信息。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 丙泊酚通过调控miR-17激活STAT3信号通路抑制人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤

前言

材料及方法

结果

讨论

结论

附录

参考文献

第二部分 丙泊酚和七氟烷对肝脏缺血／再灌注损伤的作用机制研究

前言

材料及方法

结果

讨论

结论

附录

参考文献

致谢

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附录