内质网应激在新型亚临床甲减小鼠模型脂代谢紊乱中的作用研究

摘要

目的:
　　亚临床甲状腺功能减退症，简称为亚临床甲减或者亚甲减(SCH)，是一种临床上较为常见的隐匿性甲状腺疾病。本研究首先使用抗甲状腺药物他巴唑(MMI)成功建立了一种新型亚临床甲减小鼠型（SCH模型），然后评估了SCH模型小鼠全身代谢情况和脂代谢情况，在此基础上又观察了SCH模型小鼠肝脏ER stress反应，最后对ER stress在亚甲减脂代谢紊乱中的可能作用机制进行了探讨。
　　1.建立一种新型的SCH小鼠模型。
　　2.评估SCH模型小鼠的全身代谢相关情况和脂代谢情况。
　　3.评估亚SCH模型小鼠是否存在肝脏ER stress反应。
　　4.探讨ER stress与SCH模型小鼠脂代谢的相关关系。
　　方法:
　　1.SCH模型小鼠建立方法:应用常用抗甲药物MMI（0.08 mg/kg）饮水喂养C57BL/6小鼠，创立新型的SCH模型小鼠。MMI喂养12周，16周和20周时，采用I125标记放射免疫方法检测小鼠的血清游离甲状腺素(FT4)和游离三点原氨酸(FT3)水平;采取Elisa的方法测验小鼠血清TSH情况评估小鼠的血清甲状腺功能。并检测血清谷丙转氨酶(ALT)和血清谷草转氨酶(AST)评估小鼠肝脏功能。
　　2.代谢情况评估:用TSE PhenoMaster动物代谢测量分析系统（简称为动物代谢笼系统）评估小鼠的物理活动度、产热情况、二氧化碳产量(VCO2)、耗氧量(VO2)、呼吸商(RQ)、饮食和基础代谢率(BMR)等全身代谢情况。
　　3.脂代谢情况检测:检验科检测小鼠血脂;组织胆固醇含量分析试剂盒和组织甘油三酯含量分析试剂盒检测小鼠肝脏组织脂质（胆固醇和甘油三酯）含量;菲律宾(Filipin)染色评估小鼠肝组织胆固醇积聚状况;油红O染色评估小鼠肝组织脂质积聚状况。Real-time PCR的方法检测小鼠重要脏器——肝脏的脂质合成及脂代谢枢纽分子的表达状况。
　　4.小鼠肝脏内质网应激情况检测:采取Western Blot法测验肝脏ER stress三条通路蛋白的表达状况:Bip的蛋白变化，磷酸化IRE1α和总IRE1α的蛋白水平变化，XBP1u（未剪接体形式）和XBP1s（剪接体形式）的蛋白水平程度变化，磷酸化的eif2α和总eif2α蛋白水平的变化，以及ATF6α的蛋白水平变化。
　　5.细胞培养验证:不同浓度梯度的TSH和阳性对照衣霉素（TM，ER stress激动剂）培养HepG2细胞株6小时，观察TSH对HepG2细胞的直接作用，能否导致细胞ER stress反应。采取Western Blot法检验细胞中Bip的表达程度变化，磷酸化IRE1α和总IRE1α的表达程度变化，XBP1u（未剪接体形式）和XBP1s（剪接体形式）的表达程度变化。
　　6.4-PBA改善SCH模型小鼠的脂代谢紊乱:4-苯基丁酸（4-PBA，内质网应激的化学阻断剂）注射亚临床甲减小鼠4周后，评估各组小鼠肝脏ER stress的情况，同时检测相关脂代谢情况和脂质代谢相关基因的表达情况。
　　结果:
　　1.SCH小鼠模型的建立:0.08 mg/kg·d MMI饮水喂养C57BL/6小鼠分别造模12周，16周，20周时，取血检验小鼠血清甲功指标。发现在MMI喂养小鼠12周时，模型组小鼠血清FT4、FT3测值与对照组小鼠相比无明显差异性的变化(P＞0.05);血清TSH水平模型组明显高于对照组小鼠(P＜0.05)，差异具有统计学意义。上述变化符合亚临床甲减的临床特点和诊断标准，说明在MMI饮水喂养C57BL/6小鼠12周时，已经建立成了SCH模型。MMI喂养16周时，模型组小鼠仍然保持着亚临床甲减的状态。而在MMI喂养20周时，模型组小鼠血清FT4水平明显低于对照组小鼠(P＜0.05)，说明模型组小鼠进入临床甲减状态。MMI造模时，模型组小鼠亚甲减状态大约持续8周。
　　2.SCH模型小鼠全身代谢情况评估:选用MMI喂养16周SCH模型小鼠，放入代谢笼系统监测其全身代谢情况。发现与对照组对比后，SCH模型小鼠的活动度、VCO2、VO2、RQ、产热量和BMR均无明显不同(P＞0.05)。这与亚甲减病人临床特征相符:与甲状腺机能正常人对比，无明显代谢差异，不表现出明显的低代谢特点。
　　3.SCH小鼠脂质代谢紊乱:与对照组相比，MMI喂养12周SCH模型小鼠的血脂谱和肝脏TC含量无显明差异;但此时肝脏甘油三酯含量增加(P＜0.05);肝组织切片油红O染色亦表明5CH模型小鼠脂质积聚较对照组增长。与对照组对比后发现，MMI喂养16周SCH模型小鼠血清TC，LDL-C和TG水平均有统计学意义地增长(P＜0.05);肝脏胆固醇含量(p＜0.05)和肝脏甘油三酯含量(p＜0.05)均明显增加;菲律宾(Filipin)染色和油红O染色结果也与上述数据相符合。PCR的结果显示，在SCH模型小鼠中，肝脏胆固醇合成关键基因SREBP2、HMGCR表达增高(P＜0.05)而胆固醇转化主要因子CYP7A1、HNF4α的表达下降(P＜0.05);肝甘油三酯合成代谢关键基因SREBP1C和PPARα的mRNA表达上升(P＜0.05)，脂肪酸氧化限速酶CPT1α表达同样增强(P＜0.05)。
　　4.肝细胞ER stress情况评估:SCH模型小鼠肝脏Bip、磷酸化IRE1α、及其下游XBP1s（剪接体形式）的蛋白表达皆比对照小鼠组显明增长(P＜0.05)，而其他通路中关键分子则无明显变化。说明亚临床甲减能够激发小鼠肝脏ERstress，且可能主要是通过激发IRE1α/XBP1 s通路起作用。为了进一步说明ER stress是由TSH升高导致的，本研究又采用不同浓度TSH刺激HepG2细胞同时选用TM作为阳性对照，发现TSH刺激HepG2细胞6小时后，Bip、磷酸化IRE1α、及其下游XBP1s的蛋白表达均较对照组明显增加(P＜0.05)，且对于此种刺激作用存在有显著剂量依赖性的特点。
　　5.ER stress有可能于亚临床甲减中的脂代谢紊乱中施展枢纽作用:应用ERstress阻断剂4-PBA给SCH模型小鼠连续注射4周后，发现SCH模型小鼠的脂代谢紊乱状态明显改善:血脂调整至正常程度，肝脏TC含量和肝脏TG含量也较未注射4-PBA的SCH小鼠显著下降(P＜0.05)，肝组织切片的菲律宾(Filipin)染色和油红O染色也与上述结果相一致。TG代谢和TC代谢的关键基因在分子转录水平也发生了相宜的程度变化。说明ER stress很可能在亚甲减伴随的脂代谢紊乱中发挥重要作用，当纠正了亚临床甲减的ERstress后，脂代谢紊乱明显改善。
　　结论:
　　1.应用MMI饮水喂养C57BL/6可以创立一种新型非侵入性、简单易行的SCH小鼠模型。
　　2.伴着亚甲减的历程进展，经常会伴有脂代谢紊乱。在这个过程中，ER stress很可能发挥了重要的作用。
　　3.纠正亚临床甲减的ER stress后，脂代谢紊乱得到明显改善。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

攻读学位期间参加的国际会议交流

Endoplasmic Reticulum Stress May Play a Pivotal Role in LipidMetabolic Disorders in a Novel Mouse Model of SubclinicalHvpothyroidism

High-density lipoprotein synthesis and metabolism(Review)