急性髓细胞白血病中Jab1/CSN5表达异常及相关作用机制的初步研究

摘要

白血病作为一种恶性侵袭性疾病，严重危害人类健康，有关其病因机制和干预治疗手段的研究一直都是医学科技发展的重要方向之一。急性髓细胞白血病(Acute myeloidleukemia，AML)是一种造血干细胞恶性肿瘤，主要表现为骨髓原始细胞不可调控的增殖和成熟障碍，使分化受阻，进而导致这些干/祖细胞在血液和其它器官中过度积累[1,2]，并侵犯肝、脾、淋巴结，最终侵犯全身组织、器官，抑制正常造血功能[3]。AML具有发病率高（白血病中较高，28％）、长期存活率偏低(白血病中较低，五年无病生存率30％)、缺乏有效治疗方式等特点，不仅给患者和家庭造成极大的痛苦，同时也已成为日益严重的医疗负担和社会问题。
　　Jab1/CSN5/（c-Jun activation domain-binding protein-1）最初是作为c-jun转录共激活因子被发现，后发现是CSN（COP9信号复合体）组分之一，在人、小鼠、酵母、植物中均高度保守[4]。Jab1/CSN5通过改变靶蛋白胞内定位和促进靶蛋白降解等方式负调控某些抑癌基因（如p27、p53、HIF-1、Rad51等）[5-8]，从而促进细胞增殖和DNA损伤修复[6，9]，在多种实体肿瘤中高表达并与恶性程度密切相关[3，10-14]。本实验室在2013年研究报道，Jab1/CSN5蛋白能与Smurf蛋白结合构成HECT型E3泛素连接酶参与到Smad7蛋白的泛素化降解过程，Jab1/CSN5增加会造成Smad7降解加速，导致细胞分化异常[15]。
　　本课题立足于AML病因机制的基础科学问题，以Jab1/CSN5与多种肿瘤密切相关及其在细胞分化过程发挥生物学功能为切入点[15]，利用AML患者骨髓样本检测Jab1/CSN5表达水平，进而在AML细胞系中研究Jab1/CSN5异常表达导致细胞增殖分化的变化趋势，并针对此特征，初步尝试探索光谱调制靶向调节Jab1/CSN5水平，为进一步解释AML发生发展机制和探索有关诱导分化靶向策略提供一定的科学线索和实验依据。
　　[研究目的]
　　针对Jab1/CSN5与多种肿瘤密切相关及其在细胞分化过程发挥生物学功能的特征，本课题主要针对Jab1/C SN5在急性髓细胞白血病中表达变化趋势及相关作用机制进行初步研究。
　　[研究方法]
　　1)免疫组化实验:收集数例AML患者骨髓样本和对照组（缓解期的AML患者）骨髓样本，涂片后利用DAB试剂盒检测Jab1/CSN5表达差异。
　　2)粒细胞和淋巴细胞的获取:收集5 mL AML患者骨髓，加人淋巴细胞分离液，离心后样品由上至下分为四层。其中第二层为单个核细胞层，含有淋巴细胞和单核细胞，用RPMI1640培养基培养1-2 h后单核细胞贴壁生长，悬浮细胞即为淋巴细胞;沉淀层中含有红细胞和粒细胞，用红细胞裂解液处理后分离获得粒细胞。
　　3)Western-blotting:利用分离获取的淋巴细胞和粒细胞，收集蛋白后，检测Jab1/CSN5表达情况。
　　4)病毒感染实验:分别用Jab1高表达病毒和Jab1 shRNA病毒感染HL60、K562和U937细胞，建立稳筛的细胞系。
　　5)K562细胞和U937细胞分化实验:在六孔板中接种2.0×105个K562和U937细胞，用10 ng/mL PMA处理。收集细胞，按照比例加入流式抗体，置于37℃CO2细胞培养箱中孵育30min，FACSCantoⅡ型流式细胞仪检测细胞表面分化指标CD11b、CD14和CD15的表达及利用BrdU掺入实验检测其增殖情况。
　　6)瑞氏染色:收集高表达Jab1的K562和U937细胞，涂片后用瑞氏染色法检测细胞形态的变化。
　　[实验结果]
　　1)对骨髓样本免疫组化条件进行优化。
　　2)基于优化的免疫组化条件，分别对AML发病期及缓解期患者的骨髓样本进行染色，分析比较后发现Jab1/CSN5在AML发病期患者骨髓样本中表达异常增高。
　　3)利用AML患者骨髓样本分离的淋巴细胞和粒细胞，Western-blotting实验结果表明Jab1/CSN5在粒细胞中表达显著高于淋巴细胞。
　　4)由于骨髓样本数量有限，接下来我们在白血病细胞系K562、U937和HL60中研究Jab1/CSN5对增殖分化的作用。慢病毒包装Jab1/CSN5表达载体有效感染K562和U937后，BrdU流式检测结果显示细胞增殖显著增加，而分化指标CD11b、CD14和CD15表达降低。
　　5)在白血病细胞系K562细胞中，慢病毒包装Jab1 shRNA载体有效干扰Jab1表达后，BrdU流式检测结果增殖显著降低，分化指标CD14表达增加，而CD11b、CD13、CD15表达变化不显著。
　　6)瑞氏染色方法检测高表达Jab1后K562和U937的细胞形态，结果显示原始多核细胞比例增加。
　　7)利用实验室已经建立的蓝光LED光学操控平台，发现特定参数的蓝光（波长455nm，光强100μW/cm2，时间60 min）照射K562和U937细胞后，Jab1/CSN5表达显著下降。
　　[结论]
　　本课题研究发现，Jab1/CSN5在AML发病期患者骨髓样本中表达异常增高。在白血病细胞系中，高表达Jab1后，促进细胞增殖而分化相关指标CD11b、CD14和CD15表达降低;干扰Jab1表达后增殖分化指标呈现相反趋势。此外，利用实验室已经建立的蓝光LED光学操控细胞行为实验平台，特定参数的蓝光照射白血病细胞可降低Jab1/CSN5的表达水平。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 Jab1／CSN5在AML发病期患者骨髓样本中表达增高

材料与方法

结果

讨论

第二部分 白血病细胞系K562、U937和HL60中Jab1对细胞增殖分化的作用

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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