基于微流控芯片的膀胱癌循环肿瘤细胞的特异性捕获

摘要

目的:
　　借助全新膀胱癌特异性单克隆抗体BCMab1、生物素-亲和素系统及微流控芯片技术，设计并制作膀胱癌循环肿瘤细胞特异性筛选芯片，实现对膀胱癌循环肿瘤细胞的特异性捕获，并探讨影响芯片捕获靶细胞的因素。
　　方法:
　　1.筛选芯片的设计:借助计算机辅助设计软件设计筛选芯片。整个筛选芯片由上下两部分组成，且每部分均有微结构，上部分为鱼骨结构，用于改变流体性状，下部分为微通道结构，用于捕获靶细胞。
　　2.筛选芯片的制作:制作硅片模板、用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作基片、修剪、打孔、清洗处理，等离子处理键合封接上下两部分，制成筛选芯片。
　　3.筛选芯片的表面修饰:首先，将链霉亲和素包被到微通道内;其次，对膀胱癌单克隆抗体BCMab1进行生物素化修饰;最后，将生物素化的抗体灌入微通道内，链霉亲和素与生物素化抗体结合，最终形成链霉亲和素-生物素-抗体系统。
　　4.样本液的制备:取膀胱癌细胞T24作为靶细胞，实验前用荧光染料5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)按说明对靶细胞进行荧光标记。取得实验参与者知情同意，取健康人外周血，用生理盐水稀释10倍。将标记的膀胱癌细胞T24加入到稀释10倍的人外周血液中，并根据实验需要制备不同细胞浓度的样本液。
　　5。芯片的设计分组:在实验中，为了研究抗体对靶细胞是否具有捕获作用，根据芯片表面抗体包被情况，将芯片制作成两种:有鱼骨结构及BCMab1抗体的芯片;有鱼骨结构无BCMab1抗体的芯片。
　　6.芯片捕获靶细胞:将60μ l、靶细胞浓度为5000个/ml的样本液以流速为10μl/min分别泵入到有鱼骨结构及BCMab1抗体的芯片和有鱼骨结构无BCMab1抗体的两组芯片中，冲洗后，于显微镜下观察，计数，统计捕获率。
　　7.探讨影响芯片捕获靶细胞的因素:①为了探讨流速对芯片捕获率的影响，将60μl、浓度为5000个/ml的样本液分别以流速为10、15、20、25和30μ l/min泵入到含有抗体及鱼骨结构的芯片中;②为了探讨细胞浓度对芯片捕获率的影响，将细胞浓度为500、5000和50000个/ml的样本液，以10μ l/min的速度泵入到含有抗体及鱼骨结构的芯片通道内进行筛选;③为研究鱼骨结构对芯片捕获靶细胞的影响，我们设计了两种不同的芯片，即含有鱼骨结构和未含有鱼骨结构的芯片，二者均包被BCMab1抗体，将60μl细胞浓度为5000个/ml的样本液，借助注射泵，以流速为10μ l/min分别泵入到有鱼骨结构及BCMab1抗体的芯片和无鱼骨结构有BCMab1抗体的芯片，冲洗后，于显微镜下观察，计数。
　　结果：
　　1.制作成特异性筛选膀胱癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，大小为40mm×5mm×3mm。芯片上下两层，上层为鱼骨样结构，宽50μm，高45μm，相邻两个鱼骨结构之间的间距为100～300μ m;下层为微通道，微通道高为50μm。
　　2.高倍显微镜下观察到，含有抗体及鱼骨结构的芯片对膀胱癌细胞T4具有明显的捕获作用。包被有BCMab1抗体的芯片对靶细胞捕获平均(20.8±6.3)个，未含抗体的芯片对靶细胞捕获为平均(1.2±1.1)个，二者差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.在不同细胞浓度下，芯片对靶细胞的捕获率维持在89％左右。随着流速的增加芯片对靶细胞的捕获率下降;当流速在10μ l/min时，无论是含有鱼骨结构的筛选芯片还是不含鱼骨结构的筛选芯片，对靶细胞的捕获率最大。在同一流速下，含有抗体及鱼骨结构的芯片捕获率明显高于含有抗体而未含有鱼骨结构的芯片捕获率为(P＜0.05)。
　　结论：
　　设计的捕获膀胱癌循环肿瘤细胞微流控芯片成本低，操作简单，具有高特异性捕获膀胱癌循环肿瘤细胞。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．实验材料

2 实验方法

结果

1、筛选芯片的构建

2、筛选芯片抗体的包被

3、BCMab1单克隆抗体对循环肿瘤细胞的特异性捕获

4、筛选芯片中鱼骨结构对循环肿瘤细胞的特异性捕获的影响

5、样本液流速对循环肿瘤细胞的特异性捕获的影响

6、靶细胞的数量对循环肿瘤细胞的特异性捕获的影响

讨论

结论

附图表

参考文献

文献综述

致谢

攻读学位期间发表的论文