头花千金藤碱对乳腺癌的抑制作用及逆转乳腺癌内分泌耐药的研究

摘要

研究目的:
　　乳腺癌已经成为威胁女性身体健康的常见恶性肿瘤之一。近些年来，在全世界范围内，乳腺癌在导致女性死亡的恶性肿瘤中已经跃居第二位。我国的流行病与统计学研究显示，乳腺癌的发病率与死亡率正在逐年增长。在2015年，我国大约有4，000，000女性被诊断为乳腺癌，约2，000，000女性因乳腺癌而死亡。乳腺癌的综合性治疗方案包括外科手术治疗，化学治疗，放射治疗，内分泌治疗，靶向药物治疗以及其他辅助性治疗。中医药作为乳腺癌辅助性治疗中的重要方案，已经受到越来越多的重视。头花千金藤碱是一种具有抗癌作用的中药，前期研究发现该药物具有多种对抗肿瘤的功效。但其在乳腺癌中的抗肿瘤作用机制并不明确。本文通过应用分子生物学基础技术研究，探讨中药头花千金藤碱在乳腺癌中的作用机制，为乳腺癌患者寻求新的治疗方案提供重要的理论依据。
　　研究方法及结果
　　在本课题中，我们对头花千金藤碱在乳腺癌中的作用机制进行了详细的研究，具体研究内容包括以下两部分:
　　第一部分头花千金藤碱诱导乳腺癌细胞发生自噬、凋亡和细胞周期阻滞
　　研究方法:为了检测头花千金藤碱对乳腺癌细胞的抑制作用，我们使用MTT，平板克隆形成，体外划痕实验，侵袭和迁移实验来进行验证。我们进行了进一步的研究来详细了解头花千金藤碱抑制乳腺癌细胞增殖的具体作用机制。为了检测其对乳腺癌细胞凋亡和细胞周期G0/G1期阻滞的影响，我们使用流式细胞检测术及蛋白质免疫印迹实验进行验证;通过吖啶橙荧光染色，MTT及流式细胞检测技术检测其对乳腺癌细胞自噬的影响;接着，我们通过载体构建以及蛋白质免疫印迹实验验证头花千金藤碱作用后AKT/mTOR信号通路的变化。
　　研究结果: MTT，平板克隆实验结果显示头花千金藤碱能够显著抑制乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231细胞的增殖;体外划痕，侵袭和迁移实验结果验证了头花千金藤碱能够明显抑制乳腺癌细胞的运动性;流式细胞检测术及蛋白质免疫印迹实验检测显示头花千金藤碱能够诱导乳腺癌细胞发生凋亡细胞周期G0/G1期阻滞;通过吖啶橙染色，流式细胞检测术，蛋白质免疫印迹实验及MTT实验检测显示头花千金藤碱能够诱导乳腺癌细胞发生自噬;接下来，我们在体外对乳腺癌细胞进行转染，构建AKT（pCDNA3.1-AKT）过表达细胞，再利用流式细胞检测术和蛋白质免疫印迹实验，检测结果显示头花千金藤碱通过调控AKT/mTOR信号通路进而对乳腺癌细胞发挥抑制作用。
　　第二部分头花千金藤碱逆转乳腺癌内分泌耐药的机制研究
　　研究方法:经过1年时间的研究及培育，我们团队在体外使用他莫昔芬(10μM)诱导培养出MCF-7耐他莫昔芬的耐药细胞株（M7-TR）。通过MTT实验验证他莫昔芬耐药细胞系(M7-TR)及亲代MCF-7对他莫昔芬的敏感性;利用Transwell实验检测M7-TR的侵袭和迁移能力;通过qRT-PCR及蛋白质免疫印记实验检测M7-TR细胞中EMT相关标记物的改变。接着，我们使用MTT检测头花千金藤碱对M7-TR耐药株的抑制作用;体外划痕及Transwell实验被用来检测头花千金藤碱对M7-TR耐药株侵袭和迁移能力的抑制作用;接着，通过qRT-PCR及蛋白质免疫印记实验检测头花千金藤碱作用于M7-TR细胞后EMT相关标记物的改变;接下来，我们在M7-TR细胞中进行了P65-siRNA转染，再通过MTT，蛋白质免疫印记实验及Transwell实验检测头花千金藤碱作用后M7-TR细胞中NF-κB信号通路及迁移能力的改变。
　　研究结果:MTT检测结果显示，相较于亲代MCF-7细胞，M7-TR细胞对他莫昔芬的敏感性降低;Transwell实验显示M7-TR的侵袭和迁移能力增强;同时，细胞形态学改变，qRT-PCR及蛋白质免疫印记实验检测均提示M7-TR细胞发生了明显的EMT样改变;MTT实验检测结果显示头花千金藤碱对M7-TR有显著的抑制作用;体外划痕，Transwell实验显示头花千金藤碱对M7-TR细胞的侵袭和迁移能力明显抑制;qRT-PCR及蛋白质免疫印记实验显示头花千金藤碱能逆转M7-TR细胞EMT改变;通过对M7-TR细胞进行P65-siRNA转染，通过MTT，蛋白质免疫印记实验及Transwell实验显示头花千金藤碱通过调控NF-κB通路抑制M7-TR细胞的侵袭和迁移。
　　结论:
　　1.头花千金藤碱可以诱导乳腺癌细胞发生凋亡、自噬及细胞周期G0/G1期阻滞;
　　2.头花千金藤碱通过调控AKT/mTOR信号通路，进而对乳腺癌细胞发挥抑制作用;
　　3.头花千金藤碱通过抑制乳腺癌内分泌耐药细胞发生EMT，进而对乳腺癌内分泌耐药引起的浸润转移发挥抑制作用;
　　4.头花千金藤碱通过调控NF-κB信号通路，进而逆转乳腺癌内分泌耐药;意义:
　　1、揭示了头花千金藤碱对乳腺癌细胞抑制作用的分子机制;
　　2、阐明了头花千金藤碱逆转乳腺癌内分泌耐药的作用机制;
　　3、证实了头花千金藤碱在乳腺癌中的抗肿瘤作用，为头花千金藤碱作为乳腺癌临床辅助治疗提供理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 头花千金藤碱诱导乳腺癌细胞发生自噬、凋亡和细胞周期阻滞

材料与方法

结果

讨论

材料和方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

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英文论文 Cepharanthine induces autophagy，apoptosis and cell cycle arrest in breast cancer cells