富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白在体外调节人平滑肌细胞动脉稳态的实验研究

摘要

目的:颅内动脉瘤是一个威胁生命的疾病。其是自发性蛛网膜下腔出血的首要病因，一旦动脉瘤发生破裂出血，有极高的致残率和死亡率。颅内动脉瘤的确切发病机制仍不十分明确，并且缺乏对颅内动脉瘤的发生进行筛查和对其破裂的风险进行评估特异的生物学标志物。通过文献回顾，本课题组提出“动脉稳态”(Arterial Homeostasis)的概念，即对于血流应力和血管退行性变所造成的损伤，动脉血管自身存在着一定修复的能力，从而形成损伤与修复的动态平衡来维持血管稳定，这种平衡的打破可能是颅内动脉瘤的发病机制。遗传学因素在颅内动脉瘤发病过程中所起的作用日益受到人们的关注。研究表明，富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)广泛地表达于颅内动脉瘤组织平滑肌细胞层，而其对平滑肌细胞的作用尚不十分清楚。本论文旨在研究SPARC对人血管平滑肌细胞的作用，以及这种作用是否影响了动脉稳态，从而探讨其在颅内动脉瘤发生、发展过程中可能起到的作用。
　　方法:本研究采用原代人脐动脉血管平滑肌细胞(human umbilical arterialsmooth muscle cells，HUASMCs)作为研究对象，将其分别暴露于含有(0、0.125、0.25、0.5、1、2和4ug/ml)SPARC的培养基培养24小时后，采用细胞计数试剂盒(CCK8)检测HUASMCs的细胞活力。将其分别暴露于含有(0、2ug/ml) SPARC的培养基2、6、12、24和48小时后，采用流式细胞术检测HUASMCs的细胞周期分布和细胞凋亡比率的变化;并用Western Blot技术检测HUASMCs中以下蛋白表达情况:细胞周期调控蛋白(P21、P53、CyclinD1)，细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3)，明胶酶和金属蛋白酶组织抑制剂(MMP2、MMP9、TIMP2、TIMP1)。
　　结果:将HUASMCs暴露于含有(2、4ug/ml) SPARC的培养基，作用24小时后，细胞活力相较对照组分别为89.30±2.00％和87.57±2.17％（P＜0.05 vs.对照组）。暴露于含2ug/ml SPARC的培养基，作用12小时后，处于细胞周期G0/G1期的细胞比例为74.77±1.33％（P＜0.05 vs.对照组）;作用24小时后，处于早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例分别为7.38±1.25％和4.86±0.81％(P＜0.01vs.对照组)。将HUASMCs暴露于含有2ug/ml SPARC的培养基，作用24小时后，蛋白免疫印迹灰度分析结果显示，P21蛋白含量在2-12小时显著提高(P＜0.05vs.对照组)，而P53蛋白的表达量在48小时内并没有显著地改变(P＞0.05 vs.对照组);同时，Bax蛋白水平显著地上调并于24小时达到高峰（P＜0.01 vs.对照组），而Bcl2蛋白在24小时内无显著变化但在48小时出现显著地下调(P＜0.01 vs.对照组)，Cleaved caspase3蛋白也显著上调并在24小时达到高峰(P＜0.05 vs.对照组);MMP2蛋白的含量显著增加且在24小时达到高峰(P＜0.01vs.对照组)，TIMP2蛋白的表达水平相对保持稳定;MMP9蛋白的表达量显著增加，同时也伴随着TIMP1蛋白含量的显著上调（P＜0.05 vs.对照组）。实验结果提示，SPARC可以通过提高P21蛋白的表达将HUASCMs细胞阻滞于细胞周期的G0/G1期，抑制HUASMCs细胞的增殖速度，还可以促进HUASMCs进行线粒体途径的细胞凋亡，从而降低其细胞活力;SPARC也可能通过促进明胶酶(MMP2、MMP9)的分泌，导致血管壁中细胞外基质和内弹力层的退行性变。
　　结论:实验结果提示，SPARC可能通过增加对颅内动脉中膜、内弹力层及其他细胞外基质的损伤因素，同时降低其自我修复能力，打破动脉血管损伤与修复的动态平衡，导致颅内动脉瘤的发生、发展、甚至破裂。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

“动脉稳态”的概念

SPARC对动脉稳态的影响

实验材料和方法

一、实验材料

二、试验方法

结果

(一)SPARC降低了HUASMCs的细胞活力

(二)SPARC改变了HUASMCs的细胞周期分布

(三)SPARC诱导HUASMCs中P21、CyclinD1和P53蛋白含量改变

(四)SPARC增加了HUASMCs的细胞凋亡比率

(五)SPARC诱导HUASMCs中细胞凋亡相关蛋白含量改变

(六)SPARC诱导HUASMCs中MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2蛋白含量改变

讨论

结论

附表

附图

参考文献

致谢

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