高表达CGRP对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

摘要

背景和目的:
　　牙周病是口腔的常见疾病之一，是由牙菌斑引起的慢性炎症，导致牙周组织的破坏甚至牙槽骨的严重吸收。随着组织再生工程领域的深入研究，牙周组织再生技术得以提高，其中相关细胞因子及干细胞技术的研究已取得显著成就，因牙周炎病因比较复杂，修复机制尚未明确，再生的牙周组织与健康生理性牙周组织相比不论从生理形态还是功能上都有较大的差距，临床中很难实现健康生理性牙周组织的再生。
　　降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是一种神经多肽物质，由37个氨基酸组成，因其有较多的重要调节作用且分布广泛而在实验中作为人们研究的主要神经肽物质。大量研究证实CGRP可通过多种途径调节骨组织生长代谢，实现骨组织再生的功能。本课题组前期实验研究发现:在离断下牙槽神经的大鼠实验中发现中后期再生的骨质较正常骨质疏松，骨小梁也表现的较稀疏。CGRP作为神经肽的主要物质之一可通过多种途径调节骨组织生长代谢，实现骨组织再生的功能。
　　针对以上临床难题和理论基础我们做了牙周组织再生的相关研究，借助于CGRP可促进牙槽骨代谢，重点解决再生的牙周组织在生理形态及功能上最大程度接近于健康的牙周组织，为临床中解决牙周炎引起的牙槽骨破坏实现生理性再生提供重要的理论基础。
　　方法:
　　1.rBMSCs的分离培养及鉴定
　　分离获取Wistar大鼠股骨处全骨髓并培养传代，获得稳定的第三代rBMSCs。Flow cytometer检测表面标志抗原，Oil red O、Alizarin Red染色检测rBMSCs的成脂及成骨分化能力。
　　2.rBMSCs高表达CGRP基因的构建
　　将重组慢病毒载体pLenO-DCE-CGRP与辅助包装系统共转入293T细胞中，48h、72h后收集上清液，高速离心过滤后得到高滴度病毒液，置于-80℃备用。慢病毒感染rBMSCs后检测CGRP mRNA和蛋白的表达水平。实验分为三组:CGRP组、Vector组、对照组。
　　3.高表达CGRP对rBMSCs增殖和成骨分化的影响
　　1) CCK-8、Flow cytometer检测高表达CGRP对rBMSCs增殖能力的影响;
　　2) Realtime PCR、Western Blot检测ALP（alkaline phosphatase，碱性磷酸酶）、BSP（bonesialoprotein，骨涎蛋白）、OPN（Osteopontin，骨桥蛋白）、Runx2（核心结合因子-2）mRNA和蛋白的表达水平;
　　3)通过Alizarin Red染色测定三组rBMSCs的成骨分化能力。
　　4)高表达CGRP促进rBMSCs成骨分化的机制研究
　　Western Blot检测三组细胞OPG、RANKL的蛋白表达量，统计分析OPG/RANKL。
　　结果:
　　1.rBMSCs的分离培养及鉴定
　　分离获取Wistar大鼠股骨处全骨髓并培养，细胞形态良好，大部分呈梭形，放射状排列。Flow cytometer检测第三代rBMSCs的表面标志抗原-CD34、CD45、CD44、CD90，表达率依次为0.3％、2.8％、92.3％、97.6％，符合rBMSCs表面标志物表达的特性。Oil red O、Alizarin Red染色检测成脂及成骨诱导后的rBMSCs，染色结果显示都为阳性。
　　2.rBMSCs高表达CGRP基因的构建
　　病毒液感染rBMSCs后，相对于Vector组和对照组，CGRP组的CGRP蛋白及mRNA的表达量明显升高(P＜0.05)，而Vector组和对照组表达较弱且无明显差异（P＞0.05）。
　　3.高表达CGRP对rBMSCs增殖和成骨分化的影响
　　CCK-8、Flow cytometer检测结果均显示CGRP组的rBMSCs增殖能力高于Vector组和对照组(P＜0.05);检测三组细胞矿化诱导1w、2w后ALP、BSP、OPN、Runx2 mRNA和蛋白的表达水平，检测结果显示:CGRP组较Vector组和对照组ALP、BSP、OPN和Runx2 mRNA和蛋白在1w、2w时的表达量明显增强(P＜0.05)，Vector组和对照组无明显差异(P＞0.05);rBMSCs成骨诱导4w后Alizarin Red染色CGRP组的矿化结节较其余两组多(P＜0.05)，其余两组无显著差异(P＞0.05)。高表达CGRP促进rBMSCs成骨分化的机制研究:矿化诱导1w后三组rBMSCs OPG蛋白的表达量CGRP组高于Vector组和对照组;而RANKL蛋白的表达量CGRP组低于其他两组;OPG/RANKL的统计结果显示CGRP组OPG/RANKL高于其他两组（P＜0.05），其他两组间OPG/RANKL无明显差异(P＞0.05)。高表达CGRP基因可以通过调节OPG/RANKL促进rBMSCs的成骨分化。
　　结论:
　　1.高表达CGRP基因可以促进rBMSCs的增殖。
　　2.高表达CGRP基因可以通过调节OPG/RANKL促进rBMSCs的成骨分化。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

实验一 rBMSCs的分离培养与鉴定

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

实验二 rBMSCs高表达CGRP基因的构建

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

实验三 高表达CGRP对rBMSCs增殖和成骨分化的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

附图

讨论

参考文献

致谢

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