基于甘草次酸修饰自组装胶束递药系统的研究

摘要

目前，针对肝癌的临床治疗，化学疗法依然占据着重要的地位。然而，传统的化学治疗药物在通过全身给药获得治疗效果的同时，也会因药物非特异性分布而引发严重的毒副作用，长期应用还有引发肿瘤细胞多药耐药效应，降低疗效。纳米靶向给药系统是近年来抗肿瘤药物递送领域的研究热点，它通过载体材料将药物包裹或分散于纳米级的基质当中，选择性将治疗药物递送到病灶部位，降低药物的非特异性分布，在增强药物疗效、降低毒副作用的同时，且具有一定的逆转肿瘤细胞多药耐药的能力。其中，聚合物自组装胶束作为纳米药物载体，在改善难溶性药物的溶解性的同时，可以有效地改善药物体内组织分布，提高药物的生物利用度，并实现持续、缓慢的药物释放。在聚合物自组装胶束的设计中通过化学修饰偶联肝靶向配体甘草次酸(GA)可实现药物的肝主动靶向递送，提高药物递送效率。
　　本论文通过两种不同的设计策略构建了两种新型的肝靶向聚合物载体材料，在实现药物肝主动靶向递送的同时，并探究了甘草次酸修饰在自组装载药胶束递药行为中的作用。第一种设计策略以O-羧甲基壳聚糖(OCMC)为水溶性骨架，首先通过偶联胆酸(CA)对OCMC进行疏水性修饰获得两亲性O-羧甲基壳聚糖-胆酸聚合物(CMCA)，然后将甘草次酸(GA)通过其C-3位羟基以丁二酸酐为连接臂偶联到聚合物上，并对最终的聚合物进行碱化处理，获得甘草次酸修饰的羧甲基壳聚糖-胆酸聚合物(GA-CMCA)。以CMCA和GA-CMCA为载体，以槲皮素(QC)为模型药物制备载药胶束，研究其理化性质、体外释药、体外抗肿瘤活性以及体内药物动力学特征。另以阿霉素(DOX)为抗肿瘤模型药物验证CMCA和GA-CMCA的载药能力，考察其理化性质、体外摄取、体内药动学特征、体内组织分布以及体内外抗肿瘤活性，评估所构建聚合物胶束系统的肝靶向递药能力和抗肿瘤效果。本论文第二种设计策略以低分子肝素(LMWH)为水溶性骨架材料，首先将甘草次酸通过其C-3位羟基以丁二酸酐为连接臂修饰到氨基化的LMWH骨架上得到甘草次酸修饰的LMWH(LMWH-GA)，进而将水溶性肝靶向小分子乳糖酸(LA)偶联到聚合物上获得双配体修饰的LMWH(LA-LMWH-GA)。利用GA分子的疏水作用力构建自组装胶束体系，以DOX为模型药物，考察水溶性乳糖酸修饰对载药胶束理化性质、载药与释药、体外摄取、体外抗肿瘤活性、体内药动学特征以及体内组织分布的影响，并通过对比设计策略一中GA-CMCA的药物递送行为，分析并探讨甘草次酸修饰在聚合物自组装药物递送系统中的作用，为基于甘草次酸修饰的自组装递药系统设计、提高药物肝靶向递送能力提供可借鉴的新思路。
　　本论文的主要研究内容及相关结果概括如下:
　　1.利用盐酸降解法获得分子量为17 KDa的OCMC，并以其为水溶性骨架，合成了基于OCMC的两亲性聚合物CMCA和GA-CMCA，核磁共振氢谱、红外光谱以及X射线衍射验证其结构，紫外分光光度法测定CMCA中CA的取代度以及GA-CMCA中GA的取代度。采用超声法制备空白自组装胶束，透射电镜(TEM)观察自组装胶束形态，测定粒径、Zeta电势以及临界胶束浓度(CMC)。并通过考察空白胶束的体外细胞毒性初步评估所构建胶束的安全性。结果表明，所合成的CMCA和GA-CMCA聚合物可在水介质中自组装形成大小均一的球形粒子。CMCA胶束的平均水化粒径为110～257 nm，荷有恒定的负电荷(～-20mV)，芘荧光探针法测定其CMC值为0.028～0.079 mg/ml。随着CA取代度的增加，粒径和CMC均呈现降低的趋势，但表面Zeta电位无明显变化。选用CA取代度为8.2％的CMCA进行GA进一步修饰，偶联GA后的GA-CMCA空白胶束的粒径和CMC值有变大的趋势，表面Zeta电位有所降低。研究选用GA取代度为6.5％的GA-CMCA进行后续评估。磺酰罗丹明B(SRB)实验结果显示CMCA和GA-CMCA均具有较低的细胞毒性，仅在高浓度时(＞0.25 mg/ml)，GA-CMCA才显示出不可忽略的细胞增殖抑制作用。
　　2.以QC为模型药物一，用改良的超声-透析法制备载药胶束。在相同药物/载体质量比下，GA-CMCA显示出比CMCA更强的药物包封能力，所制备的QC/GA-CMCA表现出相对较小的粒径和粒径分布。当药物/载体比为1∶5时， GA-CMCA对QC的包封率和载药量分别可达56.94％和9.69％，相应QC/GA-CMCA的平均粒径为185.5 nm，粒径多系分散系数PDI为0.130。而CMCA对QC的包封率和载药量仅为47.03％和8.32％，平均粒径和PDI分别为211.4 nm和0.171。载药胶束的体外释放结果显示QC/CMCA和QC/GA-CMCA均表现出持续、缓慢、pH响应型的释药行为。当释放介质pH值由7.4降低到6.5时，两种载药胶束的释放速度和累计药物释放量均显著增加，其中QC/GA-CMCA的释药速度和累计释药量增加更为显著。当释放介质pH值进一步降低到5.7时，QC/CMCA的释药速度和累计释药量进一步增加，而QC/GA-CMCA胶束则在释放介质中出现明显聚集沉淀，而QC也随着聚合物沉淀而析出，导致了缓慢的无突释现象的药物释放。为探究QC/CMCA和QC/GA-CMCA对环境pH值降低敏感性差异的原因，研究进一步考察了两种载药胶束在不同pH值中的Zeta电位变化，结果表明QC/CMCA和QC/GA-CMCA的Zeta电位均随着pH值的降低而降低，且QC/GA-CMCAZeta电位值降低的速度要显著快于QC/CMCA。体外抗肿瘤实验结果显示，在HepG2细胞中QC/GA-CMCA胶束显示出比QC/CMCA和QC溶液更强的细胞毒性和促进细胞凋亡的作用。此外，大鼠体内药动学研究结果表明，QC/CMCA和QC/GA-CMCA均可以显著提高QC在体内的循环时间，降低药物清除率，其药-时曲线下面积AUC0-∞分别为QC溶液组的4.9倍和7.4倍。
　　3.以抗肿瘤药物DOX为模型药物二，对CMCA和GA-CMCA的药物包封和递送能力进行验证。采用透析法在不同药物/载体质量比下制备载药胶束，CMCA和GA-CMCA的载药量随着投药量的增加而增大，但包封率呈现降低的趋势，尤其以DOX/CMCA的包封率降低更为明显。当药物/载体质量比为3∶10时，GA-CMCA对DOX的包封率为71.25％，而CMCA对DOX的包封率仅为63.41％，说明GA-CMCA对DOX具有更强的包载能力，表明在载药胶束的自组装过程中，GA会以疏水形式参与到疏水内核的形成中，增强胶束内核的作用力，加强对疏水药物的包封。综合考虑包封率和载药量指标，选用药物/载体质量比为1∶5情况下制备的载药胶束进行后续评价，测定两种载药胶束平均粒径均在200 nm左右，且荷有恒定的负电荷(～-17mV)。细胞摄取结果显示，DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA胶束可以显著提高DOX在耐药HepG2/ADR细胞中的摄取，且DOX/GA-CMCA胶束作用更为突出。HepG2/ADR细胞中的竞争抑制实验结果表明，在大量游离甘草次酸存在的情况下，DOX/GA-CMCA的摄取被显著抑制，说明DOX/GA-CMCA进入细胞与甘草次酸介导的内吞作用有关。而在HepG2细胞中，两种载药胶束的摄取均低于DOX溶液，这也间接表明DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA在HepG2/ADR细胞中是通过逆转多药耐药而达到提高DOX在胞内聚集目的的。胞内DOX分布结果揭示孵育游离DOX溶液之后，在HepG2细胞中，DOX可以快速的浓集于细胞核附近，且随着孵育时间延长荧光显著增强，而在耐药HepG2/ADR细胞中则点状零星的分布于细胞质中，且孵育2h和6h荧光强度并未发生明显变化。而HepG2细胞和HepG2/ADR细胞在经过DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA胶束孵育后，均在细胞质中看到大量的DOX聚集，且随着孵育时间的增长逐渐释放到细胞质中。这说明DOX胶束制剂进入HepG2细胞和HepG2/ADR细胞后均存在缓慢、持久的药物释放行为。
　　4.以HepG2和HepG2/ADR为细胞模型，考察了DOX载药胶束的体外抗肿瘤效果，并探讨了DOX载药胶束逆转耐药肿瘤细胞多药耐药的能力。结果表明DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA胶束均可以因其疏水内核对DOX的保护作用部分逆转HepG2/ADR细胞的多药耐药性，其多药耐药逆转指数分别为1.45和1.87。相反，在非耐药HepG2细胞中，DOX溶液具有最高的细胞增殖抑制作用，而DOX包封于CMCA和GA-CMCA后，其细胞毒性作用有所降低，这与DOX载药胶束缓慢的胞内释放有关。
　　5.分别以Wistar大鼠和昆明种小鼠为动物模型，以DOX溶液为对照，考察DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA在体内的药动学行为和组织分布特征。结果表明DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA均能够显著延长DOX在大鼠血液循环中的时间，且DOX/GA-CMCA的效果更为明显。静脉注射DOX/GA-CMCA后的药-时曲线下面积AUC0-∞是注射DOX/CMCA后AUC0-∞值的3.1倍，且其清除率仅为DOX/CMCA组清除率CL值的1/3。小鼠组织分布结果显示，DOX/GA-CMCA胶束制剂在肝中的分布要显著高于DOX溶液组和DOX/CMCA组，且在同时间点DOX/GA-CMCA胶束在肝中的分布明显高于在其他组织中的分布。定量靶向性分析结果表明，DOX/GA-CMCA胶束具有较强的肝靶向性，以DOX溶液组为对照，其在肝、脾、心、肺、肾中24 h的相对摄取率Re值分别为3.50，1.04，0.18，0.04和0.69，可见经过GA-CMCA包载在显著提高DOX在肝脏部位聚集的同时，可有效减少DOX在非靶器官，尤其是心、肺中的非特异性分布，降低药物递送毒副作用，这对提高患者依从性具有重要的临床意义。
　　6.以H-22肝癌荷瘤小鼠为动物模型，以生理盐水和DOX溶液为对照研究DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA的体内抗肿瘤效果，结果表明，DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA可显著提高DOX的体内抑瘤效果，其中GA修饰的DOX/GA-CMCA对肿瘤生长的抑制作用更为显著。此外，空白材料GA-CMCA也显示出一定的体内抑瘤效果，这与甘草次酸本身的抗肿瘤活性有关。
　　7.与策略一中首先构建两亲性CMCA聚合物从而进一步考察GA修饰对药物递送的影响不同的是，策略二中首先利用GA的疏水性进行聚合物的自组装，并进一步考察水溶性LA修饰对载药胶束药物递送的影响。该研究以分子量为4.5 KDa的LMWH为水溶性骨架，合成了LMWH-GA和LA-LMWH-GA，核磁共振氢谱及红外光谱验证其结构，并根据1HNMR中氢原子归属计算LMWH-GA中的GA取代度，元素分析方法确定LA-LMWH-GA中的LA取代度。超声法制备空白自组装胶束，TEM观察其表面形态，测定粒径、Zeta电势以及临界胶束浓度。结果表明，两种聚合物均可以在水介质中自组装成均一的球形，测定LWMH-GA胶束的粒径为109～204nm，CMC值为0.010～0.057 mg/ml，且荷有明显的负电荷(～35 mV)。选用GA取代度分别为7.47和8.94的LMWH-GA进行LA修饰获得LA取代度分别为6.32和4.31的LA-LMWH-GA。与相应的LMWH-GA相比，LA-LMWH-GA的粒径和CMC值明显增大，且表面Zeta电位显著降低(-22～-26 mV)。研究探讨了聚合物空白胶束的表观分子量与聚合物胶束粒径之间的关系，并发现凝胶渗透色谱(GPC)测定的空白胶束的表观分子量随着胶束粒径的增大而增大。溶血实验结果显示，LMWH-GA的溶血毒性随着GA取代度的增加而增大，且呈现出浓度依赖性。而经乳糖酸修饰后的LA-LMWH-GA的溶血毒性显示出一定的下降。在所有实验浓度下，GA取代度为7.47的LMWH-GA和相应的LA-LMWH-GA的溶血率均不高于5％，故该取代度下的LMWH-GA和LA-LMWH-GA可以安全的应用于注射给药。此外，SRB实验结果表明，空白胶束对对HepG2和HepG2/ADR细胞均未产生明显的细胞毒作用，可以安全的应用于药物递送领域。
　　8.以阿霉素为模型药物，探究LMWH-GA作为药物载体在肝靶向药物递送过程中的特点以及进一步水溶性LA修饰对这种递送行为的影响。透析法在不同药物/载体质量比下制备载药胶束。测定其平均粒径为77～164 nm，Zeta电位为-17～-29 mV，与空白胶束的粒径和Zeta电位相比均有所降低。在相同药物/载体质量比下，LMWH-GA对DOX显示出比LA-LMWH-GA更强的药物包载能力。当药物/载体质量比为3∶10时，LMWH-GA对DOX的包封率可达70.3％，而LA-LMWH-GA对药物的包载仅为58.44％，表明LA修饰降低了聚合物对疏水性药物的包封能力。当药物/载体比为1∶10时，两种载体材料对DOX的包封率最为接近，因此，在该项研究中，除细胞摄取及细胞毒性实验需对药物/载体比特别考察外，其他评估实验中均采用药物/载体比为1∶10制备的DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA载药胶束进行考察。两种载药胶束在体外均呈现出缓慢、持久、pH敏感型的药物释放行为:在pH=5.0酸性释放介质中的释放量显著高于在pH=7.4释放介质中的释放量，这有利于胶束在肿瘤部位发生细胞毒性作用。细胞摄取实验结果显示，DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA可以显著提高DOX在耐药细胞HepG2/ADR中的摄取，但双靶向修饰的DOX/LA-LMWH-GA并未表现出其应有的协同作用，其摄取量低于DOX/LMWH-GA。竞争抑制结果显示DOX/LMWH-GA的摄取与甘草次酸介导的内吞有关;而DOX/LA-LMWH-GA既可以通过甘草次酸受体介导进入细胞，又可以通过半乳糖受体介导进入细胞，但甘草次酸受体的作用有所减弱。内吞抑制结果表明DOX/LMWH-GA主要通过小窝蛋白途径和巨型胞饮途径两种方式进入细胞，而在DOX/LA-LMWH-GA的摄取中，这两种入胞机制的作用均明显减弱，而这可能是DOX/LA-LMWH-GA摄取率低于DOX/LMWH-GA的原因。此外，为探究材料本身在药物递送方面的作用，研究对比考察了1∶10和1∶5两种药物/载体比制备的DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA的细胞摄取行为，结果显示1∶10药物/载体质量比制备的DOX胶束制剂比1∶5药物/载体质量比制备的DOX胶束在HepG2和HepG2/ADR两种细胞中均显示出更强的被细胞摄取的能力。SRB实验结果表明DOX包载于LMWH-GA和LA-LMWH-GA中可显著提高DOX对HepG2/ADR细胞的毒性，且DOX/LMWH-GA的毒性要高于DOX/LA-LMWH-GA。而在HepG2细胞中，游离DOX溶液具有最强的细胞杀伤作用，其在两种细胞中的毒性差别间接说明DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA是通过逆转HepG2/ADR细胞多药耐药性而增强对其细胞毒性作用的。此外，在较低的实验考察浓度下，1∶10药物/载体质量比制备的DOX胶束制剂比1∶5药物/载体质量比制备的DOX胶束制剂毒性较低，而在较高的浓度下，1∶10药物/载体质量比制备的DOX胶束制剂则表现出较高的细胞增殖抑制作用。
　　9.Wistar大鼠体内药代动力学实验结果表明DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA均能够提高DOX在体内的稳定性，延长DOX在血液循环中的存留时间，其中DOX/LMWH-GA的效果更为明显。静脉注射DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA载药胶束后的AUC0-∞值分别是注射DOX溶液组的22.3倍和10.8倍，平均滞留时间则分别是DOX溶液组的8.2倍和6.5倍。小鼠体内组织分布实验结果表明两种载药胶束，尤其是DOX/LMWH-GA可以显著改善DOX在小鼠体内的组织分布，高效的靶向于肝脏，并明显降低在非靶器官尤其是心脏和肺中的分布，降低毒副作用，其在肝、心脏和肺中24h的相对摄取率Re值分别为3.23、0.10和0.05。而乳糖酸进一步修饰的DOX/LA-LMWH-GA胶束制剂并未体现出更好的肝靶向作用，其在肝脏24 h的相对摄取率Re值仅为DOX/LMWH-GA组的0.59倍，而在脾、心脏和肺中的非特异性分布则高于DOX/LMWH-GA组。这可能与LA水溶性修饰影响药物包封能力、GA受体介导能力、以及DOX/LA-LMWH-GA较快的血液清除速率有关。
　　综上所述，本研究通过不同设计策略所构建的两组新型GA修饰的自组装胶束递药系统均可以有效包载疏水性药物，且能够通过主动靶向提高药物在肝脏部位的聚集，在增强治疗效果的同时，减少药物非特异性分布造成的毒副作用。而两种GA修饰策略对自组装胶束系统药物递送行为的影响，对深入研究基于甘草次酸介导的肝靶向自组装胶束递药系统，推进高效、合理的肝靶向制剂开发具有一定的借鉴意义。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 多糖自组装胶束

2 肝靶向修饰

3 甘草次酸在肝靶向制剂中的应用

4 模型药物槲皮素和阿霉素介绍

5 本课题的设计思路

第一章 基于O-羧甲基壳聚糖自组装胶束的构建和理化性质考察

一、材料和仪器

1 材料

2 仪器

二、实验方法和结果

1 O-羧甲基壳聚糖的降解和分子量测定

2 甘草次酸修饰的O-羧甲基壳聚糖-胆酸聚合物(GA-CMCA)的合成

3 聚合物的表征

4 空白自组装胶束的制备

5 粒径、Zeta电位和透射电镜TEM观察

6 临界胶束浓度的测定

7 聚合物的细胞毒性实验

三、本章小结

第二章 载QC的GA-CMCA自组装胶束的制备、体外抗肿瘤活性及体内药动学研究

一、材料和仪器

1 材料

2 仪器

3 实验动物

二、实验方法和结果

1 QC含量测定方法的建立

2 自组装胶束中QC的含量测定

3 载药量和包封率的计算

4 载QC的自组装胶束的制备

5 载QC自组装胶束的理化性质考察

6 载QC胶束的体外释放

7 载QC胶束在HepG2细胞中的体外抗肿瘤活性研究

8 载QC胶束的体内药代动力学研究

三、本章小结

第三章 载DOX的GA-CMCA自组装胶束的制备、细胞摄取和体外抗肿瘤活性研究

一、材料和仪器

1 材料

2 仪器

二、实验方法和结果

1 DOX含量测定方法的建立

2 自组装胶束中DOX的含量测定

3 载DOX的自组装胶束的制备

4 载DOX的自组装胶束的理化性质考察

5 载DOX的自组装胶束的细胞摄取实验

6 DOX载药胶束的体外抗肿瘤效果

三、本章小结

第四章 载DOX的GA-CMCA自组装胶束体内药代动力学和组织分布研究

一、材料和仪器

1 材料

2 仪器

3 实验动物

二、实验方法和结果

1 载DOX的GA-CMCA自组装胶束在大鼠体内的药代动力学考察

2 载DOX的GA-CMCA自组装胶束在小鼠体内的组织分布研究

三、本章小结

第五章 载DOX的GA-CMCA自组装胶束在荷瘤小鼠体内的药效学研究

一、材料和仪器

1 材料

2 仪器

3 实验动物

二、实验方法和结果

1 H-22肝癌小鼠模型的建立

2 体内抑瘤率

三、本章小结

第六章 基于低分子肝素的自组装胶束的构建、理化性质和安全性评价

一、材料和仪器

1 材料

2 仪器

二、实验方法和结果

1 乳糖酸修饰的低分子肝素-甘草次酸聚合物(LA-LMWH-GA)的合成

2 聚合物的表征

3 空白自组装胶束的制备

4 粒径、Zeta电位和TEM观察

5 表观分子量GPC测定

6 临界胶束浓度的测定

7 溶血实验

8 空白胶束的细胞毒性实验

三、本章小结

第七章 载DOX的LA-LMWH-GA胶束的制备、理化性质及体外细胞活性研究

一、材料和仪器

1 材料

2 仪器

二、实验方法和结果

1 DOX含量测定方法

2 自组装胶束中DOX的含量测定

3 载DOX自组装胶束的制备

4 载DOX自组装胶束的理化性质考察

5 载DOX自组装胶束的体外释放考察

6 载DOX自组装胶束的细胞摄取和入胞机制实验

7 载DOX自组装胶束的体外抗肿瘤活性研究

三、本章小结

第八章 载DOX的LA-LMWH-GA自组装胶束体内药代动力学和组织分布研究

一、材料和仪器

1 材料

2 仪器

3 实验动物

二、实验方法和结果

1 载DOX的LA-LMWH-GA自组装胶束在大鼠体内的药代动力学考察

2 载DOX的LA-LMWH-GA自组装胶束在小鼠体内的组织分布研究

三、本章小结

全文总结与展望

1 总结

2 创新与发现

3 展望

参考文献

致谢

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