ERCC1、XRCC1多态性预测以奥沙利铂为基础化疗的晚期胃癌病人的生存期

摘要

目的:在世界范围内，胃癌是肿瘤相关死亡率第二高的恶性肿瘤，其发病率在东欧、日本和中国最高。大多数胃癌在诊断时往往已经是晚期，化疗对缓解这些病人的症状、延长生存时间有一定的姑息作用。在治疗胃癌的化疗药物中，氟尿嘧啶类药物和铂类药物是常用的有效药物，但这些药物单用或者联合应用的有效率＜50％。因此，如果有一种新的生物标志物用来预测化疗药物治疗的有效率，则病人有可能会从有选择的特异性化疗方案中获得更多的益处。在治疗胃癌的化疗药物中，目前临床上应用最多的铂类药物是奥沙利铂。奥沙利铂是继顺铂、卡铂之后的第三代铂类药物，通过与鸟嘌呤交联从而引起DNA损伤，发挥抗肿瘤的作用。胃癌病人化疗后，随着时间的延续，特别是经过多周期化疗后，常常会发生肿瘤耐药现象。肿瘤耐药的机理非常复杂，其中有一部分与DNA损伤的修复有关，通过核苷酸切除修复(NER，nucleotide excision repair)和碱基切除修复(BER，base excision repair)途径修复损伤的DNA可以引起铂类药物的耐药。切除修复交叉互补蛋白1(ERCC1，excision repair cross-complementing protein1)和X线修复交叉互补蛋白1(XRCC1,X-ray repair cross-complementing protein1)分别是NER和BER途径的关键蛋白，已被确认是影响铂类药物有效率的重要因素。因此，从理论上来说，ERCC1和XRCC1的检测可能有助于判断化疗的有效性，只是对于应用奥沙利铂化疗的晚期胃癌病人来说，相关基因的预测价值目前仍存有争议。所以，在晚期胃癌病人中，有必要对这些基因的表达与疗效的相关性再做进一步研究。基于以上原因，这项研究的目的是探讨89例接受以奥沙利铂/5-氟尿嘧啶为一线化疗方案的晚期胃癌病人ERCC1和XRCC1基因多态性与临床疗效的关系。
　　方法:本研究的115例病人皆在青岛大学医学院附属医院肿瘤中心接受治疗，时间自2009年9月至2011年9月，皆病理学证实为胃癌。
　　研究标准如下:1）所有病人皆为Ⅳ期;2）病人的ECOG评分＜2;3)病人之前未行化疗;4）充分的骨髓功能(定义为中性粒细胞绝对值大于1，500/μL，血小板计数大于100，000/μL)，肾功能(血清肌酐≤1.5mg/dl;或者科克罗夫特计算公式得到的肌酐清除率≥50ml/min)和肝功能(天门冬氨酸氨基转移酶＜40U/L和丙氨酸氨基转移酶＜45U/L;总胆红素＜17.1μmol/L);和5）心功能＞Ⅱ级，分级按照先前纽约心脏协作组的定义。根据上述标准，89例病人适用于此项研究。
　　病人应用每三周重复的调整的FOLFOX方案做为一线治疗:奥沙利铂，130mg/m2，第1天;亚叶酸钙，130mg/m2，第1-5天，5-氟尿嘧啶(5-FU)，300mg/m2，第1-5天。一直应用到疾病进展、化疗毒副作用不能耐受或者病人拒绝继续化疗为止。
　　所有病人至少化疗2周期。治疗前要有二维可测量的计算机断层影像(CT)或者核磁共振影像(MRI)。治疗之后，每6周复查CT或MRI以评价疗效。疾病控制率(DCR，disease control rate)[完全缓解(CR)+部分缓解(PR)+稳定(SD)]的评价根据实体肿瘤反应评价标准(RECIST1.1)。总生存(OS)被定义为从初始治疗开始到死亡的时间或到末次随访的时间。
　　在化疗之前，先应用血基因组DNA提取工具从2ml外周血中提取DNA。利用Roter基因实时36孔聚合酶链反应(PCR)系统通过TaqMan基因分型分析来分析ERCC1和XRCC1的基因多态性。TaqMan分析的每25-μL反应液包含:1.25μl探针，12.5μl PCR混合试剂和20ng基因DNA。PCR条件:起始温度95℃，持续10分钟，然后92℃持续15秒变性，经过48个循环周期，最后退火。在60℃持续1分钟。为了使结果可信，随机选择的30份DAN样本，每份至少进行2次检测。
　　应用x2检验以及哈迪-韦因贝格均衡来分析基因型的分布。应用卡普兰-迈耶方法来评估生存曲线，用log秩和检验来评价病人的生存时间以及基因多态性。另外，应用考克斯比例风险回归模型来获得风险比(HR)和95％可信区间(CI)数值;所有的分析根据年龄、性别、一般行为状况评分、组织学类型、肿瘤的位置以及转移数目的不同进行统计学的研究。优势比(OR)和95％可信区间同时计算。而且，所有报道的P值是双侧的，P≤0.05被认为有统计学的差异。所有的数据分析应用SPSS软件进行。
　　应用定量聚合酶链反应来确定基因多态性，经过两个周期化疗后，分析ERCC1密码子118C/T和XRCC1密码子399A/G的多态性与疾病控制率(DCR)、中位生存时间(mOS)的关系。
　　结果:病人的化疗疗效:2009年9月至2011年9月，共随访89例胃癌病人，中位随访时间12个月（范围4-16个月）。89例病人中有29例女性(32.58％)，60例男性(67.42％)，中位年龄为53岁（范围32-70岁）。病人对化疗的反应如下:CR2例;PR18例;SD38例;PD31例;中位生存时间(mOS)8个月（95％可信区间，6.739月-9.261月）。
　　ERCC1和XRCC1基因多态性的频率:所有病人进行血液标本的PCR分析，用以明确ERCC1密码子118的多态性;其中有43例(48.31％)病人是纯合子C/C基因型，9例(10.11％)是纯合子T/T基因型，37例(41.58％)是杂合C/T基因型。XRCC1密码子399多态性的分析表明，45例病人(50.56％)是纯合子G/G基因型，8例(8.99％)是纯合子A/A基因型，36例(40.45％)是杂合子G/A基因型。另外，ERCC1和XRCC1的基因型频率应用哈迪-韦因贝格均衡进行分析。
　　ERCC1C118T多态性与疗效之间的联系:ERCC1不同基因型和DCR之间有明确的联系(P=0.044)。但是，这种统计学的意义在调整的逻辑回归分析中不再明显(P=0.852)。这可能表明不能由此来预测病人的DCR。含有1个或2个T等位基因预示较短的中位生存期。例如，含有ERCC1CT和TT基因型的病人的中位生存期是7个月，而含有ERCC1CC基因型病人的中位生存期是9.5个月。而且，log秩和检验显示ERCC1CC基因型与mOR明显相关(P=0.001)。
　　XRCC1A399G多态性与疗效的相关性:XRCC1基因型与DCR有明显的相关性(P=0.015)，但是，这种统计学的意义在调整的逻辑回归分析中不再明显(P=0.060)。这可能表明XRCC1尚不能用来预测DCR。含有1个或2个G等位基因的病人有明显的较优的中位生存期(G/A和A/A基因型者7.0个月，G/G基因型者9.5个月，P=0.001)。log秩和检验显示研究的两种类型的基因多态性与中位生存期有关(P=0.001)。两组进一步的联系应用Cox回归分析。
　　联合检测ERCC1C118T和XRCC1G399A多态性与治疗结果的相关性:根据上述的研究结果，本研究试着探讨是否有一种基因型的模式，临床可以用来评价胃癌病人预后的不同。ERCC1C/C和XRCC1G/G被定义为有利的基因型。一个有利的基因型是与组中病人的剩余的两种不利的基因型相对而言的。24例病人有两个有利的基因型（组一），50例病人有一个有利的基因型（组二），25例病人没有有利的基因型。（组三）。DCR与不同的基因型组别有明显的相关性(P=0.001)。根据目前的分析，病人含有一个或两个有利基因型的中位生存期分别为8.5个月和9.5个月，而不含有利基因型的病人的中位生存期仅有5个月。有一个有利基因型的病人（组二）或者没有有利基因型的病人（组三）与含有两个有利的基因型（组一）的参照组的病人相比，死亡的相对风险比是2.498(95％可信区间，1.298-4.807)和3.102(95％可信区间，1.451-6.632)。三个组的卡普兰-迈耶曲线，通过Cox回归来进行分析。另外，病人的一般身体状况以及转移数目与中位生存期有关，一般身体状况与中位生存期有相关性（95％可信区间，3.704-11.185;P＜0.001），转移数目与中位生存期有相关性(95％可信区间，1.001-1.816;P=0.049)。相反，性别、年龄、肿瘤的位置以及肿瘤的分化与中位生存期没有明显的相关性。
　　结论:目前研究显示，针对以奥沙利铂为基础一线化疗方案的晚期胃癌病人，XRCC1399的两种基因多态性，以及联合XRCC1和ERCC1多态性的表达，是治疗的独立预后因素。但是，应用基因多态性来进行预测会受一些临床特征的影响，如病人的一般状况评分，转移病灶的数目等。受样本数目的限制，需要更大的随机对照前瞻性的研究来获得更准确的数据。

目录

声明

摘要

前言(综述)

第四章 材料与方法

4．1 材料

4．2 实验仪器与试剂

4．3 方法

4．4 样本ERCC1和XRCC1基因SNP分型

第五章 研究对象的用药与疗效观察

5．1 化疗方案

5．2 疗效评价

5．3 统计学分析

6．1 基因分型

6．2 ERCC1基因多态性与临床获益率的关系

6．3 XRCC1基因多态性与l临床获益率的关系

6．4 联合检测ERCC1和XRCC1多态性与临床获益率的相关性

第七章 结论

第八章 讨论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间研究成果