TNFAIP8L2调控端粒酶活性促细胞衰老的机制研究

摘要

研究目的：
　　1.探讨TIPE2在细胞衰老中的作用；
　　2.阐明TIPE2调控端粒酶活性参与细胞衰老的分子机制；
　　3.探讨TIPE2调控的细胞衰老在肿瘤发生中的作用及机制。
　　研究方法：
　　1.体内实验
　　1.1 动物模型
　　SPF级野生型C57(WT)和TIPE2-/-雄性小鼠分为两组，每组20只，独立饮食饲养，分别在3个月、24个月处死小鼠，留取小鼠新鲜血清，检测比较C57和TIPE2-/-小鼠血清中的白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(ASTL)、谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆固醇(CHO)等的差异。取C57小鼠的肝、肾、脾等新鲜组织，一份冻存于-80℃，待冰冻切片后通过IHC方法检测TIPE2表达差别，一份新鲜组织提取蛋白质，以Western blot方法检测不同年龄C57小鼠的TIPE2表达。
　　1.2 动物模型中TIPE2的表达检测
　　上述C57小鼠新鲜脾组织切小块，研磨棒研磨提取蛋白，用TIPE2(JinSiTe，1∶500)、β-actin(proteinteck，1∶1000)为一抗，用Western blot的方法测检测蛋白表达。肝组织冰冻切片，以TIPE2(JinSiTe，1∶200)为一抗，做IHC，DAB显色观察TIPE2表达区别。
　　2.体外实验研究TIPE2在细胞衰老中的作用
　　2.1 细胞培养
　　结肠癌细胞系HT-29、原代培养的小鼠肺呼吸道平滑肌细胞ASMC和人胚肾上皮细胞系293T均培养在含有10％胎牛血清RIPA1640培养基中，结肠癌细胞系SW480培养于含10％胎牛血清的F100中，细胞放置在37℃、5％CO2湿润的细胞培养箱中进行培养。
　　2.2 TIPE2表达水平与细胞衰老
　　用Western blot的方法检测TIPE2在不同代数的原代培养ASMC细胞（7代，14代）中的表达差异。以pRK5-TIPE2表达质粒及空载质粒对照转染ASMC或HT29细胞，同时在转染的HT29细胞中给予加速细胞衰老的刺激H2O2，用SA-β-gal染色检测细胞衰老指标β-半乳糖苷酶，比较分析TIPE2表达水平与细胞衰老之间的关系。
　　2.3 TIPE2过表达对细胞增殖及细胞周期的影响
　　TIPE2表达质粒转染HT-29和ASMC细胞，用Western blot的方法检测过表达TIPE2后Caspase-3活性与P21蛋白的表达变化，CCK-8的方法检测细胞增殖情况，用流式细胞术检测TIPE2过表达后细胞凋亡及细胞周期的变化。
　　3.TIPE2对细胞端粒酶的调控作用及机制
　　3.1TIPE2过表达对hTERT表达以及活性的影响
　　TIPE2表达质粒转染结肠癌细胞系HT-29、SW480，一定时间后通过Western blot的方法检测TIPE2过表达对hTERT的蛋白水平的影响，用端粒酶TERT活性检测试剂盒检测TIPE2过表达后端粒酶hTERT的活性，分析TIPE2表达水平与hTERT活性之间的关系。
　　3.2 TIPE2调控hTERT的分子机制的研究
　　TIPE2表达质粒转染HT-29细胞，Western blot的方法检测过表达TIPE2后细胞的TGF-β、c-myc的表达水平及细胞信号通路p-Smad3、Smad3、Erk的活化情况，同时用核质分离的方法检测细胞核、细胞质内与端粒酶调控有关的转录因子c-myc以及c-Ets-2的表达水平与分布情况。Co-IP的方法检测TIPE2与转录因子c-myc、c-Ets-2结合情况。
　　研究结果：
　　1.TIPE2在组织内的表达水平随小鼠年龄增长而增强
　　Western blot方法检测到TIPE2在24个月C57小鼠脾组织中的表达水平明显高于3月小鼠，IHC检测亦发现24月C57小鼠组织中TIPE2染色较强，提示TIPE2随小鼠年龄增长呈现高表达趋势。
　　检测3个月、24个月TIPE2-/-与C57小鼠的缸清指标，24个月TIPE2-/-小鼠肝功能指标如碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(ASTL)、谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆固醇(CHO)等的血清学水平明显高于3个月TIPE2-/-小鼠，但较同龄的野生型小鼠明显降低。24个月TIP E2-/-小鼠白蛋白(ALB)水平低于3个月小鼠，但明显高于同龄C57小鼠。这些结果说明TIPE2随小鼠年龄增长表达增高的同时肝功能明显下降，提示TIPE2在小鼠体内可能具有一定的促衰老作用。
　　2.TIPE2具有促进体外培养细胞衰老死亡的作用
　　2.1 TIPE2表达水平增高可以加速细胞衰老
　　TIPE2在高传代（14代）原代培养ASMC细胞的表达水平明显低于低代细胞（7代），β-半乳糖苷酶阳性细胞在TIPE2过表达的细胞内明显多于对照细胞，给予H2O2刺激后发现H2O2在加速细胞衰老（β-半乳糖苷酶阳性细胞增多）的同时显著上调TIPE2的蛋白表达水平。这些结果都提示TIPE2高表达可以加速细胞衰老。
　　2.2 TIPE2具有促进细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用
　　HT29细胞和ASMC细胞中过表达TIPE2之后检测细胞周期发现细胞周期被阻滞在G1期，细胞生长明显被抑制，Caspase3活性增强。在HT-29细胞中过表达TIPE2过表达质粒，AnnexinⅤ/PI检测结果显示TIPE2过表达的细胞凋亡明显增多，发现细胞周期蛋白P21表达明显升高，同时p-IκB通路活化被抑制，这些结果均提示TIPE2显著抑制细胞增殖、促进细胞死亡。
　　3.TIPE2通过调控hTERT活性促进细胞衰老
　　3.1 TIPE2具有抑制hTERT活性的作用
　　在结肠癌细胞系HT-29，和SW480中过表达TIPE2后发现，hTERT蛋白水平明显下降，同时端粒酶活性亦明显降低，表明TIPE2能够抑制hTERT活性。
　　3.2 TIPE2具有通过Erk/c-myc通路调控hTERT的作用
　　Smad、c-myc、c-Ets-2是端粒酶hTERT启动子调控区重要的顺式作用元件，因而TIPE2转染细胞HT-29后，利用Western blot检测c-myc表达情况，结果发现核转录因子c-myc的表达在TIPE2过表达后较对照细胞明显下降，核质分离实验发现TIPE2过表达后细胞核中的c-myc蛋白水平亦显著下降，提示TIPE2不仅降低c-myc表达，而且可以抑制c-myc进入细胞核。另外，TIPE2转染细胞的Erk磷酸化水平显著降低，给予Erk磷酸化抑制剂可以完全抑制住TIPE2对c-myc的影响，但不能够完全抑制TIPE2对hTERT的影响，提示TIPE2除了降低c-myc表达抑制端粒酶活性外尚可能存在其它调控方式。
　　3.3 TIPE2具有通过结合c-Ets-2抑制hTERT的作用
　　在HT-29细胞系中TIPE2过表达后细胞c-myc的核转录因子c-Ets-2蛋白水平较对照细胞明显下降，但是核质分离实验发现TIPE2过表达细胞内c-Ets-2蛋白仅在细胞核中减少，在细胞质中反而增多，提示TIPE2可能阻滞c-Ets-2的入核。进一步Co-IP实验发现TIPE2可以与c-Ets-2结合，证实TIPE2在细胞质内结合c-Ets-2后抑制其入核，最终抑制hTERT的转录。
　　3.4 TIPE2具有通过TGF-β/Smad3通路调控hTERT的作用
　　HT-29细胞转染TIPE2，Western blot检测发现TGF-β蛋白水平明显高于对照细胞，p-Smad3水平亦显著高于对照细胞，说明TIPE2过表达能够显著上调TGF-β，激活Smad3通路。
　　TGF-β是Smad信号通路的重要调节因子，由于TIPE2可以激活Smad信号通路，因而进一步研究了TGF-β是否能够影响TIPE2。细胞HT-29转染TIPE2表达质粒，免疫荧光检测发现TIPE2进入细胞核，TGF-β作用于细胞不仅能够显著增加TIPE2蛋白水平，而且促进TIPE2进入细胞核。而截短型TIPE2并不影响TIPE2进入细胞核。
　　研究结论；
　　1.TIPE2通过抑制hTERT的表达及活性促进细胞衰老;
　　2.TIPE2主要在基因水平上调控hTERT转录。TIPE2下调转录子c-myc、c-Ets-2表达，减少c-myc、c-Ets-2结合hTERT启动子区域，进而抑制hTERT转录;
　　3.TIPE2对端粒酶相关转录因子的调控与Smad、Erk信号通路有关;
　　4.TIPE2可以通过抑制肿瘤细胞的端粒酶活性抑制肿瘤细胞的生长，发挥抗瘤作用。
　　创新点及意义
　　1.首次阐述了免疫负调节分子TIPE2在细胞衰老过程中的作用及分子机制，丰富了TIPE2的功能。
　　2.研究发现TIPE2主要通过调控端粒酶hTERT的基因转录进而抑制端粒酶hTERT的活性。
　　3.以调节细胞衰老为切入点提出TIPE2抑制端粒酶活性抗肿瘤的新思路。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

研究结果

1．TIPF2在组织内的表达水平随小鼠年龄增长而增强

2．TIPE2具有促进体外培养细胞衰老死亡的作用

3．TIPE2通过调控hTERT活性促进细胞衰老

讨论

结论

创新点及意义

参考文献

致谢

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