Purmorphamine对大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的神经保护作用及其机制研究

摘要

Shh信号通路在CNS胚胎发育以及疾病发生发展中发挥着重要作用，但但它对SAH后神经细胞和组织再生/修复的影响尚未得到很好的研究，作为Smo受体激动剂PUR在SAH中的研究尚未见报道。我们本实验的目的是通过PUR干预大鼠SAH模型，评估PUR对大鼠蛛网膜下腔出血后EBI和神经功能的影响以及PUR对SAH后EBI作用机制的探讨，以期为SAH后EBI的治疗提供新的见解。
　　第一部分 Purmorphamine在大鼠SAH后EBI中的神经保护作用
　　目的:
　　通过建立大鼠SAH模型，利用Smo受体激动剂PUR干预来研究其对大鼠SAH后EBI的影响。
　　方法:
　　1.分组:将162只健康成年雄性Wistar大鼠(280-350g)随机分为6组:假手术+生理盐水组（Sham组），SAH+生理盐水组，SAH+PURl(0.5mg/kg)组，SAH+PUR2(1mg/kg)组，SAH+PUR3（5mg/kg）组和SAH+PUR(1mg/kg)+cyclopamine(Cyc，1mg/kg)组。SAH模型:采用枕大池注入自体股动脉血方法建立，枕大池注入等体积生理盐水方法建立SAH对照组模型。在SAH模型组后2小时、6小时、24小时和46小时腹膜内注射不同剂量(0.5，1，5mg/kg)的PUR，而SAH+PUR(1mg/kg)+Cyc（1mg/kg）组在腹腔注射1mg/kg PUR的同时腹腔注射1mg/kg Cyc，对照组腹腔注射等体积的生理盐水，然后在SAH后48小时将大鼠处死后取脑，进行组织测定。
　　2.检测指标及方法:每组取15只进行神经功能评分，然后随机选取6只进行脑组织水含量的测定，方法:Elliott干湿重法;每组取4只进行前额叶皮层(prefrontal cortex，PFC)组织损伤情况的检测，方法:HE染色;每组取3只进行PFC神经细胞凋亡情况的检测，方法:TUNEL染色。
　　结果：
　　1.PUR对SAH后的死亡率，神经功能的影响
　　所有SAH大鼠进行死亡率统计，每组随机选取15只进行神经功能评分，结果显示，与Sham组相比(0％)，SAH组的死亡率较高(17.86％)，PUR干预的SAH大鼠组（0.5，1和5mg/kg）死亡率与SAH组相比没有统计学差异(12.5％，8.33％，4.16％)。采用Sugawara评分系统对各组大鼠进行神经功能评估，SAH组较Sham组出现显著的神经功能缺陷(p＜0.001)。而PUR干预组大鼠评分（0.5，1和5mg/kg）明显改善(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.01)，联合应用Cyc可抑制PUR对SAH后神经功能评分的改善(p＜0.05)。
　　2.PUR对SAH后脑含水量的影响
　　从各组大鼠中随机选取6只采用干湿重法进行脑组织含水量的测定，结果显示，与Sham组相比，SAH后组脑水含量显着增加(p＜0.01)，而在0.5，1和5mg/kg的PUR干预后，脑含水量显著减少(p＜0.05,p＜0.01,p＜0.01)。使用shh信号通路抑制剂Cyc后，PUR对脑含水量的作用减弱(p＜0.05)。
　　3.HE染色显示PUR减轻SAH诱导的脑细胞损伤
　　为评估PUR对SAH后脑损伤的影响，我们每组随机选取4只大鼠以进行HE染色并分析，结果所示，在Sham组大鼠PFC具有清晰的结构层，皮质神经元呈现清晰的边界。而在SAH组中，神经细胞稀疏排列，细胞轮廓模糊。此外，SAH组的PFC神经元萎缩，并且有明显的水肿带。而使用PUR干预SAH大鼠则能缓解SAH诱导的这种损伤。
　　我们进一步检测PFC中含有固有核的嗜酸性粒细胞的数量，结果显示，与Sham组相比，SAH组嗜酸性粒细胞数量明显增多(p＜0.001);与SAH+生理盐水相比，在48小时SAH后，PUR干预组(0.5，1和5mg/kg)PFC中嗜酸性粒细胞数量明显减少(p＜0.01,p＜0.001,p＜0.001);联合应用Cyc逆转PUR的这种作用(p＜0.01)。
　　4.TUNEL染色显示PUR减轻SAH诱导的脑细胞凋亡
　　TUNEL染色显示Sham组PFC中凋亡细胞较少见，然而，在SAH损伤后48小时，TUNEL阳性细胞明显增加(P＜0.001)。与SAH+生理盐水相比，PUR干预组(0.5，1和5mg/kg)PFC中TUNEL阳性细胞明显减少(p＜0.05,p＜0.001，p＜0.001);此外，联合应用Cyc可使TUNEL阳性细胞再次增多(p＜0.01)。
　　结论：
　　1.大鼠SAH后48h，脑组织水肿程度以及神经功能缺陷显著加重，TUNEL阳性细胞明显增多，提示神经细胞凋亡增加。
　　2.PUR干预后抑制SAH大鼠神经性功能缺陷，减轻脑水肿，减少神经细胞凋亡，应用阻断剂环巴胺处理后逆转这种效果，提示PUR对SAH后EBI具有神经保护功能。
　　第二部分 Purmorphamine对大鼠SAH后神经保护作用的机制研究
　　目的:
　　探讨PUR对大鼠SAH后EBI神经保护作用机制。
　　方法:
　　1.分组与SAH模型同第一部分。然后在SAH后48小时将大鼠处死后取脑，进行组织测定。
　　2.检测指标及方法:每组取3只进行cleaved caspase-3/NeuN染色检测PFC神经元凋亡情况;Western blot以及RT-PCR法检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3的表达检测凋亡情况;每组取6只检测PFC中MDA的含量;Western blot以及RT-PCR法检测转录因子E2相关因子2(NF-E2-related factor2,Nrf2)和血红素氧化酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)的表达检测氧化应激;Western blot以及RT-PCR法检测细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、p-ERK、Shh、Gli-1、Patched的表达变化，检测PUR在SAH中神经保护作用的分子机制。
　　结果：
　　1.SAH后PUR对caspase-3活化的影响
　　为了研究PUR的潜在保护机制，我们在SAH后进行活性caspase-3/NeuN染色。结果显示:caspase-3/NeuN双阳性染色的神经元在SAH组比Sham组明显增多(p＜0.001)。而PUR（0.5，1和5mg/kg）干预的SAH组中caspase-3/NeuN双阳性染色的神经元显著减少(p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05)。western blot检测证实SAH显著上调cleaved caspase-3蛋白表达(p＜0.001);而按照1和5mg/kg剂量的PUR干预后cleaved caspase-3表达水平显着降低(p＜0.01,p＜0.01)。联合应用Cyc可抑制PUR下调cleaved caspase-3效果(p＜0.05）。
　　2.PUR对SAH后SAH诱导的Bcl-2和Bax变化的影响
　　为了进一步证实PUR针对SAH损伤的抗神经元凋亡作用，我们通过Westernblot和RT-PCR检测抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax的表达。结果显示，与Sham组相比，SAH后48h，PFC中Bcl-2的表达显著下调，而Bax的表达上调，导致Bax/Bcl-2比率在mRNA和蛋白水平显着增加(p＜0.001,p＜0.001)。而PUR干预后几乎完全逆转了SAH后Bax和Bcl-2的表达以及Bax/Bcl-2比率的改变。与SAH+PUR组相比，联合应用Cyc可抑制PUR这种效果。
　　3.在SAH后PUR对MDA水平和Nrf2和HO-1表达的影响
　　与Sham组相比，在SAH后48小时PFC中MDA水平显著增加(p＜0.001);与SAH组相比，PUR(0.5，1和5mg/kg)干预组的MDA水平显著降低(p＜0.05,p＜0.001,p＜0.001)。与Sham组相比，在SAH后48小时PFC中Nrf2和HO-1的表达增加(p＜0.05,p＜0.05);与SAH组相比，PUR(1和5mg/kg)干预后显著进一步上调SAH组中Nrf2的水平(p＜0.001,p＜0.05)，PUR（1mg/kg）干预后显著上调SAH组中HO-1的水平(p＜0.01)。与SAH+PUR组相比，联合应用Cyc可增加MDA水平(p＜0.05)，降低Nrf2和HO-1的表达(p＜0.05)。
　　4.PUR提高SAH后的ERK1/2磷酸化水平
　　通过Western blot检测各组PFC中ERK和p-ERK的表达。结果发现在SAH后显著降低ERK1/2磷酸化水平(p＜0.001），而应用0.5和1mg/kg PUR干预后可明显上调ERK的磷酸化水平(p＜0.05,p＜0.05)，进一步联合应用Cyc可抑制PUR这种效果(p＜0.05）。
　　结论：
　　1.PUR能够抑制SAH诱导的Bax/Bcl-2比率及cleaved caspase-3表达水平的升高，从而抑制神经细胞凋亡。
　　2.SAH能够引起明显氧化应激反应，而PUR能通过上调PFC中的Nrf2和HO-1表达来减轻SAH后氧化应激所造成的损伤。
　　3.PUR的神经保护可能主要通过特异性激活Shh信号通路和ERK通路，发挥对SAH后EBI的神经保护作用。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：Purmorphamine在大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的神经保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第二部分：Purmorphamine对大鼠SAH后神经保护作用的机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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