神经肽P物质对大鼠肝纤维化及肝星状细胞活化的作用及机制研究

摘要

肝纤维化（hepatic fibrosis）是与慢性肝脏损伤有关的修复反应过程，是各种慢性肝病进展至肝硬化的中间过程和必经阶段，其最重要的特征是含有丰富Ⅰ型胶原蛋白的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成增多，降解减少，这种失衡导致胶原在肝脏组织中过度沉积，部分患者最终发展为肝硬化(livercirrhosis)、肝癌。
　　近年来，P物质(substance P，SP)及其受体(NK-1 receptor，NK-1R)介导的神经源性炎症越来越受到重视，SP与其受体结合后，通过激发免疫细胞浸润和细胞因子释放的瀑布式级联反应在疼痛、肝炎、心肌炎、胆汁淤积、菌血症、病毒感染等病理生理过程中发挥重要作用。此外，SP及其受体同样参与了血管的形成、肿瘤细胞的增殖、迁移及影响抗凋亡效应。本实验研究了SP对肝星状细胞活化、增殖及对肝纤维化的影响，并初步探讨其内在作用机制。
　　第一部分 SP对大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞增殖、活化及凋亡的影响
　　目的:
　　检测系列浓度的SP在不同的处理时间下对大鼠HSC-T6细胞增殖的影响，同时利用油红染色检测系列浓度SP对HSC-T6细胞活化的影响以筛选出SP最佳作用浓度。在此基础上，应用NK-1R受体阻滞剂(L732138)共处理细胞，并检测SP/NK-1R受体阻滞剂对HSC-T6细胞凋亡的影响，并行western-blot检测HSC-T6细胞活化相关蛋白表达变化，以评估SP/NK-1R受体阻滞剂对肝星状细胞增殖、活化及凋亡的影响。
　　方法:
　　1.使用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基常规培养HSC-T6细胞，应用系列浓度的SP（10、50、100、500、1000、5000nM）分别作用HSC-T6细胞6/12h，行MTT/LDH检测细胞活性。
　　2.系列浓度的SP(10、50、100、500、1000、5000nM)处理HSC-T6细胞，行油红染色、western-blot检测HSC活化蛋白α-SMA/CollagenⅠ表达变化。
　　3.应用NK-1R受体阻滞剂L732138与SP共培养HSC-T6细胞，行MTT/LDH检测细胞活性，油红染色，western-blot检测α-SMA/CollagenⅠ蛋白水平，评估对HSC-T6活化的影响。
　　4.Hoechst33342/PI双染，流式细胞术检测SP及L732138对HSC-T6细胞凋亡的影响。
　　结果:
　　1.系列浓度的SP（10-5000nM）处理细胞6h，MTT/LDH检测显示各浓度组无明显差异。12h时，500/1000nMSP均可明显升高MTT值并降低LDH的释放。
　　2.油红染色显示500/1000nMSP可明显促进HSC-T6细胞脱脂滴，western-blot检测示500/1000nMSP促进α-SMA/CollagenⅠ蛋白表达。
　　3.NK-1R阻滞剂L732138可显著抑制SP对HSC-T6细胞增殖的促进作用，并抑制SP引起的HSC-T6脱脂滴，及α-SMA/CollagenⅠ蛋白表达的上调。
　　4.凋亡相关检测显示，500/1000nMSP抑制HSC-T6细胞的凋亡，该作用可被 NK-1R受体阻滞剂L732138阻滞。
　　结论:
　　1.较低浓度(10-100nM)的SP在较短作用时间内(6 h)对HSC-T6细胞活性无明显影响，500/1000nM SP作用HSC-T6细胞12 h，可明显促进HSC-T6细胞活性，抑制凋亡并促进HSC-T6细胞活化。
　　2.NK-1R受体阻滞剂L732138可抑制SP对HSC-T6细胞活性、增殖及活化的促进作用，并促进HSC-T6细胞的凋亡，表明在体外实验中，L732138至少可部分抑制SP对肝纤维化的促进作用。
　　第二部分 SP在CCl4诱导大鼠肝纤维化模型中的作用
　　目的:
　　应用CCl4建立大鼠肝纤维化模型，并同时给予SP受体(NK-1R)阻滞剂L732138治疗，行HE/Masson/天狼猩红染色及western-blot检测α-SMA/CollagenⅠ评估SP及L732138对肝纤维化影响，并检测大鼠血清学指标以评估SP及L732138对大鼠肝功能的影响。
　　方法:
　　1.建立CCl4大鼠肝纤维化模型:6周龄成年雄性Wistar大鼠（体重:180-220 g），于每周二、周五给予50％ CCl4橄榄油混合液(1 ml/kg)腹腔注射，共6周，每周两次，建立CCl4大鼠肝纤维化模型。
　　2.实验动物分组及药物处理:实验动物共分3批次进行，每批次使用18只Wistar大鼠。18只Wistar大鼠适应性饲养1周后，随机分为三组，每组6只，即正常生理盐水对照组，CCl4模型组，CCl4+L732138药物干预组。模型组大鼠处理方式如上。正常生理盐水处理组:给予相同剂量的生理盐水-橄榄油混合液（按照1∶1比例混合均匀后使用）。药物干预组于CCl4造模处理前一天（即每周一、周四）给予L732138右下腹腔注射（0.5 mg/kg），共6周，每周两次。于末次给药后24 h，将全部大鼠利用10％水合氯醛麻醉，心脏取血并处死，并迅速取出大鼠肝组织，行4％多聚甲醛固定，部分新鲜肝组织-80℃冰箱保存。
　　3.肝组织免疫组织化学染色:测定CCl4模型组SP及NK-1R表达变化。取新鲜肝组织，常规石蜡包埋，切片，抗原修复后，1％ BSA封闭，兔抗SP/NK-1R一抗过夜，荧光二抗室温2h行荧光显色，常规DAPI染液染核，荧光显微镜下观察拍照。
　　结果:
　　1.免疫组织化学染色结果显示，与对照组相比，CCl4肝纤维化模型鼠肝组织SP及NK-1R表达明显升高。
　　2.HE染色结果显示，正常对照组大鼠肝脏无明显的病理变化。CCl4模型组大鼠可见肝脏发生大量的空泡样变，部分肝细胞坏死;另有大量的炎性细胞浸润及纤维间隔形成。L732138可在一定程度上抑制CCl4介导的肝纤维样变，该组大鼠肝组织炎性浸润细胞减少，纤维间隔同样较少。Masson/天狼猩红染色显示，模型组大鼠可见大量的纤维间隔形成，L732138可减轻模型组肝纤维化程度。
　　3.Western-blot检测结果显示，CCl4模型组大鼠肝纤维化相关蛋白α-SMA/CollagenⅠ表达水平较正常对照组明显升高;与模型组相比，L732138干预处理后可显著降低肝组织a-SMA/CollagenⅠ蛋白表达水平，但仍高于正常对照组。
　　结论:
　　1.CCl4大鼠肝纤维化模型中，肝组织SP及NK-1R蛋白表达水平明显升高。
　　2.NK-1R受体阻滞剂L732138可在一定程度上减轻肝损伤，降低肝纤维化程度，发挥抗肝纤维化作用。
　　第三部分 SP影响肝星状细胞增殖/活化及肝纤维化的机制研究
　　目的:
　　初步探讨SP影响HSC活化及肝纤维化的内在机制，为肝纤维化的治疗提供理论基础。
　　方法:
　　1.为排除细胞种属对实验结果的影响，本实验同时在大鼠肝星状细胞系HSC-T6及人肝星状细胞系LX2中进行，不同药物处理后，提取细胞总蛋白行western-blot检测，观察SP及NK-1R受体阻滞剂对肝纤维化密切相关信号通路TGFβ1/Smad-3蛋白表达的影响。
　　2.为进一步验证SP影响肝星状细胞活化及肝纤维化是否通过TGFβ1/Smad-3信号通路，我们应用TGFβ1受体抑制剂SB431542处理细胞，并行MTT/LDH检测细胞活性，油红染色检测细胞活化情况，western-blot检测肝纤维化相关蛋白α-SMA/CollagenⅠ表达水平。
　　结果:
　　1.Western-blot结果显示，500 nM及1000 nM SP可明显促进HSC-T6细胞及LX2细胞中TGF-β1，p-Smad-3蛋白表达;NK-1R受体抑制剂L732138可显著抑制两种细胞系中SP对TGFβ1/Smad-3信号通路的上调作用。2.油红染色结果显示，与1000 nM SP组相比，应用TGFβ1抑制剂SB431542处理细胞可明显抑制HSC-T6细胞脱脂滴，即抑制细胞的活化;MTT/LDH检测结果表明SB431542可抑制细胞的增殖，并降低肝纤维化相关蛋白α-SMA/CollagenⅠ的表达。但与L732138处理组相比，差异有统计学意义，说明L732138抑制细胞增殖/活化及肝纤维化的机制不完全通过TGFβ1/Smad-3信号通路。
　　3.与L732138对肝星状细胞增殖活化的影响一致，另一种NK-1R受体阻滞剂RP67580同样可抑制SP对肝星状细胞增殖活化的促进作用，并抑制肝纤维化相关蛋白α-SMA/CollagenⅠ的表达。
　　结论:
　　1.SP通过TGFβ1/Smad-3信号通路促进肝星状细胞增殖活化及肝纤维化。
　　2.L732138抑制肝星状细胞增殖/活化及肝纤维化的机制不完全通过TGFβ1/Smad-3信号通路。
　　3.L732138可通过抑制肝脏的内质网应激来抑制肝纤维化。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：SP对大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞增殖、活化及凋亡的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分 SP在CCl4诱导大鼠肝纤维化模型中的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第三部分 SP影响肝星状细胞增殖／活化及肝纤维化的机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

综述 P物质与纤维化疾病

致谢

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