PDCD4缺失的巨噬细胞对肝细胞肝癌的抑制效应及可能的机制

摘要

研究目的：
　　肿瘤免疫治疗在肿瘤治疗中发挥重要作用。特别是近年来靶向T细胞的治疗，特别是CART在于血液肿瘤治疗上取得的进展，引起人们的广泛关注。但是由于T细胞的迁移能力弱，故CART对实体肿瘤的治疗效果有限。肿瘤微环境中存在大量的免疫细胞，其中肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤微环境的主要免疫细胞，TAM不仅具有直接的抗肿瘤作用，而且在启动特异性细胞免疫和体液免疫中起关键作用。然而，大量的研究结果证实，肿瘤（如，肝细胞肝癌）局部的TAM呈现M2样表型，具有促进肿瘤的作用。因此，新一代免疫肿瘤药物靶向TAM以获得更有效的治疗癌症的有效应答策略。另外，巨噬细胞具有很强的迁移能力，通过改造巨噬细胞将成为实体肿瘤免疫细胞治疗的新策略。
　　Pdcd4（程序性细胞死亡4）是一种新型肿瘤抑制基因，已报道通过调节肿瘤细胞凋亡，细胞周期、细胞自噬和细胞增殖来抑制肿瘤发生。然而，我们和其他学者的研究发现PDCD4也参入免疫细胞功能的调控。我们的前期研究显示PDCD4可通过抑制巨噬细胞炎性因子，抑制炎症相关的肿瘤（结肠癌）;Pdcd4缺乏还可增强巨噬细胞脂自噬并减轻巨噬细胞泡沫化形成，抑制动脉粥样硬化;另一项研究表明Pdcd4调节巨噬细胞替代性激活和抗原诱导的肺部炎症中气道重塑的标志物。这些结果提示PDCD4参与巨噬细胞功能的调控。然而，PDCD4表达对巨噬细胞抗肿瘤作用有何影响？是促进肿瘤的生长还是抑制肿瘤的生长？如果有影响，可能的机制是什么？这些问题尚不清楚。
　　本课题以PDCD4敲除的巨噬细胞和肝细胞肝癌为模型，在体内外研究了PDCD4敲除的巨噬细胞的抗肿瘤效应，并从巨噬细胞M1和M2极化入手，探索了其作用机制。我们发现了PDCD4敲除的巨噬细胞表现出更强的抗肿瘤效应，其主要机制是PDCD4缺失抑制肿瘤微环境对M2巨噬细胞表型的诱导分化。为以Pdcd4敲除巨噬细胞治疗肿瘤奠定基础。
　　研究方法：
　　1.体外研究PDCD4缺失对巨噬细胞抗肿瘤作用的影响
　　(1)分别从6-8周龄WT和Pdcd4敲除基因小鼠取骨髓细胞，利用M-CSF细胞因子诱导获得骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)
　　(2)BMDM巨噬细胞与小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞共培养不同时间（24、48和72小时）
　　(3)用MTT法测定巨噬细胞对肿瘤细胞生长的影响
　　(4)使用ANOVA统计分析数据
　　2.小鼠体内研究PDCD4缺失对巨噬细胞抗肿瘤作用的影响
　　(1)分别将来自野生型和PDCD4-/-小鼠的BMDMs(4×106)与H22细胞(1×107)混合
　　(2)分别注射到BALBc小鼠的左右后腿，每隔3天测量肿瘤的大小，绘制生长曲线
　　(3)16天后处死小鼠并收集肿瘤，称重
　　(4)肿瘤浸入甲醛中固定并制备病理切片，H&E染色进行病理学检查
　　3.在M1和M2极化的条件下，研究PDCD4缺失对巨噬细胞极化的影响
　　(1)分别从6-8周龄WT和Pdcd4敲除基因小鼠取腹腔巨噬细胞(PM)
　　(2)用LPS诱导巨噬细胞向M1分化;用IL-4诱导巨噬细胞向M2分化
　　(3)用实时荧光定量PCR和ELISA方法检测M1和M2表型标志分子和细胞因子的表达
　　4.在肿瘤生长的微环境下，体外研究PDCD4缺失对肿瘤相关巨噬细胞表型的影响
　　(1)分别用WT和Pdcd4敲除基因小鼠骨髓细胞，利用M-CSF细胞因子诱导获得BMDM
　　(2)将Hepa1-6细胞培养的上清液分别加入培养的WT巨噬细胞和PDCD4-/-巨噬细胞
　　(3)24小时、48小时后收集细胞，用实时荧光定量PCR和ELISA方法检测M1和M2表型标志分子和细胞因子的表达
　　5.PDCD4缺失对小鼠皮下肿瘤微环境中巨噬细胞表型的影响
　　(1)分别将来自野生型和PDCD4-/-小鼠的BMDMs(4×106)与H22细胞(1×107)混合
　　(2)分别注射到BALBc小鼠的左右后腿。
　　(3)16天后处死小鼠、收集肿瘤，分离单个细胞
　　(4)用流式细胞术分析巨噬细胞M2群体表型
　　研究结果：
　　1.体外实验显示Pdcd4缺失促进巨噬细胞的抗肿瘤作用
　　为了研究PDCD4对巨噬细胞抗肿瘤作用的影响，我们分别从WT和PDCD4-/-小鼠获得BMDM，与小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞共培养不同时间，然后用CCK8法测定肿瘤的生长状况，结果显示PDCD4-/-的巨噬细胞能更有效的抑制肿瘤细胞的生长。
　　2.小鼠移植瘤实验证明Pdcd4缺失增强巨噬细胞抗肿瘤作用
　　为了进一步在体内证明Pdcd4缺失对巨噬细胞抗肿瘤作用的影响，我们把BMDM与H22肝癌细胞混合，注射到小鼠皮下。为了排除小鼠的个体差异，每只小鼠一侧为WT组，另一侧和PDCD4-/-组。结果显示单独H22组肿瘤生长很快，WT巨噬细胞具有抑制肿瘤的作用，然而，Pdcd4-/-巨噬细胞抗肿瘤作用更强，并且病理学检测显示Pdcd4-/-组的肿瘤组织中坏死的面积更大。说明PDCD4缺失促进巨噬细胞的抗肿瘤作用。
　　3.M1和M2极化的条件下，Pdcd4缺失抑制M2极化而促进M1的极化
　　已知M1型巨噬细胞具有抗肿瘤的作用，M2型巨噬细胞具有促进肿瘤生长的作用，为了探索Pdcd4缺失增强巨噬细胞抗肿瘤的机制，我们首先在M1和M2极化的条件下，研究了Pdcd4缺失对巨噬细胞极化的影响。结果显示Pdcd4缺失上调M1巨噬细胞IL-6的表达，但对ICOS和TNF-α等其他M1表达没有明显影响。然而，Pdcd4缺失明显抑制M2的表型（如，Arg-1，CD206，IL-10），提示PDCD4缺失抑制M2、促进M1的极化。
　　4.在肿瘤培养上清液存在的条件下，Pdcd4缺失抑制巨噬细胞向M2分化
　　由于我们发现Pdcd4巨噬细胞与Hepa1-6细胞共培养，可显着抑制Hepa1-6细胞的体外增殖。故我们推测在共培养的微环境中，Pdcd4的缺失也可能影响巨噬细胞的极化。我们将肿瘤细胞培养的上清液加到巨噬细胞的培养液中，培养24h和48h后，用qRTPCR和ELISA检测M1和M2的表型分子，结果发现在肿瘤培养上清存在条件下，Pdcd4缺失的巨噬细胞表达高水平IL-6等M1表型，而抑制Arg-1、CD206、IL-10和TGF-β等M2表型，并且对M2表型的抑制更明显。说明在肿瘤培养上清液存在的条件下，Pdcd4缺失抑制巨噬细胞向M2分化，这可能是Pdcd4缺失增强其抗肿瘤作用的机制之一。
　　5.在小鼠肝癌移植瘤模型中，Pdcd4缺失的巨噬细胞抵抗肿瘤细胞对其向M2的诱导
　　分别取小鼠皮下移植的H22肿瘤组织，分离单个细胞，用流式细胞术检测巨噬细胞在肿瘤微环境的表型，结果显示H22与WT巨噬细胞接种的肿瘤组织中巨噬细胞有高水平M2标志(F4/80+CD206+)，但H22与Pdcd4缺失型巨噬细胞接种的肿瘤组织中M2巨噬细胞很少。说明在肿瘤的生长过程中肿瘤细胞可诱导野生型巨噬细胞向M2分化，进而有利于肿瘤的生长，但Pdcd4缺失的巨噬细胞可抵抗其向M2极化，更有利于其抗肿瘤效应的发挥。
　　研究结论：
　　1.体内外实验证明Pdcd4缺失的巨噬细胞具有更强的抗肿瘤作用，可能成为新的抗肿瘤的免疫细胞，具有潜在的应用价值
　　2.已知M1型巨噬细胞具有抗肿瘤的作用，M2型巨噬细胞具有促进肿瘤生长的作用。我们发现Pdcd4缺失抑制巨噬细胞向M2分化，促进其向M1分化，这可能是Pdcd4缺失增强其抗肿瘤作用的机制之一。

目录

声明

CONTENTS

Abstract

摘要

Abbreviations

Section Ⅰ：Introduction

1．Epidemiology and pathogenesis

2．Biology of hepatocellular carcinoma

3．Multidisciplinary care of HCC

4．Evidence based guidelines for HCC treatment

5．Tumor-Associated Macrophages(TAMs)

6．Immunotherapy

7．Programmed cell death 4(Pdcd4)

8．Purpose

Section Ⅱ：Materials and Methods

Section Ⅲ：Results

2．Pdcd4 deficient macrophages suppress Hepatocellular carcinoma growth in mouse models

3．Pded4 deficiency impactthe polarization of M1 and M2 maerophage in vitro

4．Pdcd4 deficient macrophages resist M2 polarization induced by supernatants of tumor cells cultured

5．Pdcd4 deficient macrophages inhibits the macrophages alternatively activation and re-educate TAMS in tumor microenvironment in liver mouse models

Section Ⅳ Discussion

Conclusion

References

Acknowledgements

Published Article