铜绿假单胞菌中C-di-GMP调控MapZ与CheR1相互作用的结构学研究

摘要

铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是一种普遍存在的革兰氏阴性条件致病菌，当身体存在伤口或免疫力低时易感染，并有可能迸发慢性感染最终导致死亡。因此铜绿假单胞菌是医院手术后感染的一个重要致病菌，并常存在于患有囊性纤维化人体中引起肺部感染。
　　多种核酸小分子的衍生物被发现广泛参与胞内或胞外的信号传导，其中环二鸟苷酸(c-di-GMP)在各种细胞功能中发挥重要的功能。c-di-GMP能够刺激生物被膜中黏附素(adhesin)的合成，并且抑制各种形式的运动，即c-di-GMP可以控制细菌从运动的悬浮态到静止的生物被膜之间不同生活型的转变。在细菌中，某些特定信号的传递是通过c-di-GMP的浓度变化来传递的。细菌细胞中c-di-GMP的浓度主要由两条途径维持:二鸟苷酸环化酶(DGCs)对c-di-GMP的降解以及磷酸二酯酶(PDEs)的合成。
　　生物被膜是细菌成长过程中为顺应生活环境从而黏附于生物体或组织表面，并保护微生物群体免受外部伤害的保护性组织。细菌被包埋于其本身产生的胞外基质中，其主要成分是一些多糖、纤维蛋白、脂蛋白和DNA等复杂成分。虽然生物被膜在一定程度上使细菌与环境隔离，但在其上散布着一些通道允许物质的交换和信号的传递。
　　甲基转移酶(MTases)在各种生命形式中无处不在，涉及到DNAs，RNAs和蛋白特异位点的共价修饰。甲基转移酶根据其结构特点主要分为五类，大多数的S-adenosyl-(L)-methionine(SAM)-dependent MTases(SAM-MTases)属于Class I，辅因子SAM是经典的甲基供体，在各种生物反馈中起着关键的作用。趋化性蛋白甲基转移酶(CheR)是细菌化学感应信号通路的重要成分。细菌趋化性的前期研究主要集中在大肠杆菌(Escherichia coli)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。这两种菌都只有一个CheR基因和少量的化学感受蛋白。P.aeruginosa有4个CheR同源蛋白和26个化学感受蛋白。这4个甲基转移酶(CheR1，CheR2，CheR3和WspC)分别位于四个不同的化学感应基因簇中。CheR蛋白通常含有一个由甲基转移酶结构域组成的化学受体结合腔和一个β-subdomain。甲基转移酶结构域会与CheR受体甲基化区域有直接相互作用，同时β-subdomain会结合受体中的一个特殊序列（五肽），该序列一般存在于其受体的C端。
　　c-di-GMP浓度的信号会被很多对应的受体捕捉到，这种信号的传递具有多样性和复杂性。到现在为止已经鉴定出多种多样的c-di-GMP的受体，这其中大部分的结构并没有得到解析。P.aeruginosa具有高度复杂的c-di-GMP信号网络。其基因组中存在18个GGDEF，5个EAL，16个同时含有GGDEF/EAL和3个HD-GYP蛋白。在P.aeruginosa基因组中，有7个蛋白含有PilZ domain，包括多域蛋白Alg44，双域蛋白FlgZ和PA2989，和四个仅含有single-domain PilZ蛋白HapZ、MapZ、PA0012和PA4324。据报道，HapZ与组氨酸激酶SagS有相互作用，且这种相互作用可以通过提高c-di-GMP浓度来进一步加强。MapZ也被报告可以抑制甲基转移酶CheR1的活性，与HapZ相似，这种抑制可在c-di-GMP的存在时得到增强。
　　在这里，我们报道了关于含SAH的CheR1的C-domain的晶体结构和CheR1与c-di-GMP结合MapZ的复合晶体结构。可观察到MapZ在CheR1的结合位点部分与SAH/SAM-binding口袋重叠。因此，MapZ的结合可以阻碍SAH/SAM的结合。这提供了直接的结构证据在c-di-GMP的作用下，MapZ对CheR1的抑制机制。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．1 铜绿假单胞菌

1．1．1 铜绿假单胞菌的简介

1．1．2 生物被膜

1．1．3 细菌生物被膜与鞭毛

1．2 第二信使c-di-GMP

1．3 趋化性甲基转移酶

1．4 课题研究主要内容

第二章 蛋白质CheR1的结构研究

2．1 蛋白质CheR1

2．2 实验材料

2．2．1 菌种和质粒载体

2．2．2 常用工具酶和试剂

2．2．3 配制试剂

2．2．4 实验仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 蛋白质CheR1的相关克隆

2．3．2 蛋白质表达纯化

2．3．3 蛋白质的结晶和优化

2．3．4 蛋白晶体的衍射和数据收集

2．4 实验结果

2．4．1 CheR1全长的纯化实验结果

2．4．2 CheR1蛋白质的普筛和晶体优化

2．5 本章小结

第三章 蛋白MapZ和CheR1复合物的结构研究

3．1 蛋白MapZ

3．2 实验方法

3．2．1 蛋白MapZ、CheR1和OheR1 C-domain的相关克隆

3．2．2 蛋白MapZ、CheR1和OheR1 C-domain的表达纯化

3．2．3 c-di-GMP的制备

3．2．4 蛋白MapZ全长、CheR1全长和c-di-GMP的结晶

3．2．5 体外Ni-NTA pull-down实验

3．3 实验结果

3．3．1 蛋白MapZ全长的实验结果

3．3．2 蛋白CheR1-notag和CheR1 C-domain-notag的实验结果

3．3．3 蛋白MapZ、CheR1和c-di-GMP复合物普筛和晶体优化

3．3．4 蛋白MapZ、CheR1和c-di-GMP复合物结构的确定与修正

3．3．5 蛋白MapZ、CheR1和c-di-GMP复合物结构的结果及分析

3．4 本章小结

全文总结

参考文献

硕士期间发表论文

致谢