异化硝酸盐还原菌(DNRA)的环境分布及富集培养研究

摘要

当前硝酸盐废水十分普遍，主要来源有城镇生活污水，农业废水以及核工业核武器制造业、果胶、煤产品、肥料、金属加工等工业废水。硝酸盐废水的排放是引起水体富营养化的一个重要来源，对生态系统和人类危害巨大。这类废水的生物处理是水污染治理的重要课题。传统的异化硝酸盐去除途径反硝化和厌氧氨氧化将其转化为氮气，继而排放到大气环境中，而另一种途径异化硝酸盐还原为铵(DNRA)在硝酸盐去除过程也起到不可忽略的作用，它将硝酸盐转化为铵盐，保留在水体中。因此，探究DNRA和反硝化过程的竞争机制十分有必要。
　　本论文基于人工湿地和黄河口两个典型不同的自然生境，调查DNRA菌和反硝化菌的竞争条件，DNRA菌的群落多样性从而进行反应器优化富集培养。研究内容主要有三方面:(1)调查新薛河人工湿地及黄河口DNRA菌、反硝化菌、厌氧氨氧化菌的分布情况，探究环境因子的相关影响;(2)优化DNRA菌培养条件，在无纺布膜生物反应器内富集培养DNRA菌;(3)综合比较湿地，黄河口与反应器内DNRA菌群落组成。取得的主要成果如下:
　　(1)DNRA菌在自然水生生态系统普遍存在，不同生境不同采样点其活性和丰度有都差异。一般情况下DNRA菌活性与丰度有正相关关系。并且DNRA菌喜欢高C/N比、硝酸盐限制的中性偏碱的还原性环境。人工湿地底泥中DNRA菌的丰度，群落多样性均高于黄河口，更加说明高有机碳环境更适宜DNRA菌生存，两者相比人工湿地底泥更适宜作为富集DNRA菌的接种物。
　　(2)对比污水处理厂活性污泥，发现活性污泥更适宜作为接种污泥，进而用无纺布膜生物反应器优化的富集DNRA菌条件:C/N比为10，温度控制为23℃，pH约为7.1，COD与普通配水分开两股连续进水，其中碳源COD为乙酸钠，持续搅拌混合，充氮气维持厌氧环境。液位控制器控制出水，最高液面开始出水，最低液面停止出水，从而控制水力停留时间(HRT)约为38h。在此条件下，137天成功富集培养DNRA菌，最后硝氮转为氨氮效率为60.65％。最终DNRA菌功能基因nrfA的丰度达到3.02E7copies/ng DNA。
　　(3)批式实验证明，反硝化和DNRA过程都是分步进行的，首先都是将硝态氮还原为亚硝态氮。批式环境无法实现硝酸盐限制条件，反硝化活性远远大于DNRA，所以DNRA更适合在连续流环境中生存。
　　(4)反应器中存在反硝化菌，铁还原菌(FeRB)，硫酸盐还原菌(SRB)，硫氧化菌(SOB)和发酵细菌五大功能类群，在这些微生物催化作用下碳氮硫循环互相影响促进，形成一个有机整体。基于功能预测发现了大量亚硝酸盐还原酶（产铵方向）的存在，证明DNRA富集物形成。反应器内主要的DNRA菌包括铁还原菌FeRB，一部分SRB和Thauera菌。
　　(5)在新薛河人工湿地，黄河入海口和反应器污泥中，丰度最高的DNRA菌门类都是变形菌门Pro teobacteria，绿弯菌门Chloroflexi和疣微菌门Verrucomicrobia，其中Deltaproteobacteria是最重要的纲。然而主要的功能菌属不同，湿地底泥中丰度最高的功能属是Anaeromyxobacter，而黄河入海口底泥和反应器培养污泥中优势菌属是地杆菌Geobacter。

目录

声明

摘要

1．1 水体氮循环

1．2 水体氮素污染

1．2．1 我国水环境资源污染现状

1．2．2 水体硝酸盐污染

1．3 异化硝酸盐为铵(DNRA)

1．3．1 DNRA生理过程

1．3．2 DNRA酶系及功能基因

1．3．3 DNRA细菌的分类

1．3．4 DNRA过程的影响因素

1．4 异化硝酸盐为铵(DNRA)的研究现状

1．4．1 DNRA过程在水生生态系统中的重要性

1．4．2 I)NRA在实验室中研究进展

1．5 本课题的研究内容和目的意义

1．5．1 研究目的

1．5．2 研究内容

1．6 技术路线图

第二章 异化硝酸盐还原菌在人工湿地中的分布

2．1 取样地点及取样方法

2．1．1 新薛河人工湿地概况

2．1．2 样品采集

2．2 测试方法

2．2．1 基本测试指标

2．2．2 样品DNA提取

2．2．3 实时荧光定量PCR

2．2．4 高通量测序

2．3 异化硝酸盐还原菌的分布及影响因子研究

2．3．1 人工湿地环境理化因子

2．3．2 异化硝酸盐还原菌的丰度分布

2．3．3 人工湿地DNRA菌群落分析

2．3．4 环境因子影响分析

2．4 本章小结

第三章 DNRA菌在河流河口中的分布

3．1 取样地点及取样方法

3．1．1 黄河入海口概况

3．1．2 样品采集

3．2 测试方法

3．2．1 潜在DNRA速率测定

3．2．2 其他方法

3．3 DNRA菌的分布及影响因子的分析

3．3．1 黄河入海口理化因子

3．3．2 DNRA菌的活性及丰度

3．3．3 DNRA菌的微生物群落分析

3．3．4 环境因子影响分析

3．4 本章小结

第四章 DNRA菌的富集培养

4．1 实验装置、接种污泥与运行方法

4．1．1 实验装置与运行条件

4．1．2 接种污泥与配水方案

4．2 分析项目及测试方法

4．2．1 常规指标的测定

4．2．2 高通量测序

4．2．3 批式实验

4．3 氮素转化分析

4．4 反应器细菌组成分析

4．4．1 功能微生物的q-PCR结果分析

4．4．2 反应器污泥群落结构

4．5 DNRA功能菌群落结构分析

4．6 本章小结

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的学术成果