长链非编码RNA TCONS_00075467在心房颤动兔心房电重构中的功能及其机制研究

摘要

目的：
　　基于右心房快速起搏(atrial tachypacing，A-TP)构建实验性房颤兔模型，应用二代高通量测序检测房颤及对照兔右心房中lncRNAs的差异表达，并通过一系列生物信息学方法，鉴定与房颤心房电重构相关的lncRNAs。应用敲低实验实现功能沉默，研究目标lncRNA在兔心房电重构及房颤发生中的作用;并阐明目标lncRNA影响房颤电重构的分子机制，推动lncRNAs在房颤发生中的研究，有利于对房颤发病机制的揭示和临床潜在防治靶点的筛选。
　　方法：
　　1.构建实验性房颤兔模型
　　将12只健康成年新西兰白兔随机分为房颤组和对照组。对房颤组行手术将起搏电极置于右心房，以额定频率600次/分(10Hz)连续起搏7天建立实验性房颤兔模型。对照组行同样手术但不起搏。并于手术前和手术7天后分别行心内电生理检查，包括AERP和房颤诱发性。
　　2.lncRNAs的高通量测序并验证
　　TRIzol法提取3只对照组及3只房颤组兔右心房中总RNAs，进行二代高通量测序，检测基因转录本及lncRNAs的表达变化。行实时定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)，验证测序结果的准确性。
　　3.生物信息学分析及筛选
　　对表达变化显著的转录本行Gene Ontology(GO)富集分析及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路分析;基于表达变化量、靶基因预测、保守性分析、共表达分析、组织特异性等生物信息学及统计方法，筛选并鉴定与心房电重构相关的全新转录本。
　　4.预测lncRNAs的作用机制
　　(1)cis-机制
　　通过基于位置关系的cis-机制筛选lncRNAs所在基因组区域上下游10kb以内的转录本，明确lncRNAs及其上下游邻近转录本的表达变化趋势是否具有相关性。
　　(2)trans-机制及共表达分析
　　通过基本局部比对搜索工具(BLAST)来评估lncRNAs与转录本序列形成复合物的可能性;根据皮尔逊相关系数(COR)及P值，计算并选取|COR|＞0.85、P＜0.05与lncRNAs共表达的转录本;对这些转录本行GO富集分析及KEGG通路分析，预测lncRNAs的trans-作用机制。
　　5.目标lncRNA的功能缺失实验
　　(1)在体感染
　　体外构建阴性对照慢病毒、TCONS_00075467的沉默慢病毒及ocu-miR-328的沉默和过表达慢病毒，滴度为1×109TU/ml。将25只健康成年新西兰白兔随机分为阴性对照组、TCONS_00075467沉默组、ocu-miR-328沉默组、ocu-miR-328过表达组、TCONS_00075467沉默和ocu-miR-328沉默慢病毒共感染组。麻醉开胸后，将相应的慢病毒在体多点斜行注射至右心房中，感染7天后处死，低温留存心房组织备用，冷冻切片观察荧光强度，检测感染效率。分别于感染慢病毒前、感染慢病毒即刻、感染慢病毒7天后检测AERP、房颤诱发性等电生理学指标。
　　(2)细胞感染
　　提取兔原代心房肌细胞培养。将细胞随机分为空白对照组、阴性对照组、TCONS_00075467沉默慢病毒组、ocu-miR-328沉默慢病毒组、ocu-miR-328过表达慢病毒组、TCONS_00075467沉默慢病毒与ocu-miR-328沉默慢病毒共感染组。48h后开始在荧光显微镜下观察感染细胞的荧光强度;培养96h后提取RNA和蛋白质。
　　6.分子生物学指标的检测
　　TRIzol法提取感染后组织和细胞的总RNAs，qRT-PCR方法检测TCONS_00075467、ocu-miR-328的表达量;应用Western Blotting方法测定靶基因CACNA1C蛋白的表达水平。
　　7.荧光原位杂交实验
　　细胞爬片置于4％多聚甲醛（DEPC水配制）中固定，滴加含5ng/μl寡核苷酸荧光探针的杂交液（TCONS_00075467探针为Cy3标记，ocu-miR-328探针为Dylight488标记），37℃杂交过夜;DAPI染液复染细胞核;爬片于Olympus荧光显微镜下观察并采集图像(Cy3红光激发波长550nm，Dylight488绿光激发波长492nm)。
　　8.荧光素酶分析报告
　　合成TCONS_00075467基因的DNA片段、ocu-miR-328靶基因CACNA1C的3'UTR DNA片段野生型，并合成其突变型DNA片段，构建picheck-2荧光素酶载体;应用荧光素酶报告基因来检测ocu-miR-328与载体结合后的荧光强度，用于验证CACNA1C基因为ocu-miR-328的靶基因、TCONS_00075467与ocu-miR-328间存在相互作用。
　　9.膜片钳实验
　　配制细胞外液和电极内液;制备玻璃电极，所用电极控制在3-5MΩ，并填充电极内液，银丝镀氯;将接种于爬片上的心肌细胞置于显微镜(OlympusⅨ-70)下方槽内，加入预热37℃的细胞外液，并将参比电极放入细胞外液中;应用Axopatch700B放大器记录全细胞模式信号;信号以1kHz行过滤，应用Digidata1550B数模/模数转换器获取数据。L型钙离子电流（ICaL）在全细胞电压钳模式下记录，APD在电流钳模式下记录。
　　结果：
　　1.基于A-TP成功构建实验性房颤兔模型，房颤组AERP明显缩短，房颤诱发率增高。
　　2.通过房颤与非房颤兔右心房组织的二代高通量测序，发现99843种全新lncRNAs转录本，其中1220个全新转录本lncRNAs存在显著性差异表达，其中983个转录本表达下调，237个转录本表达上调。随机选取6个全新的lncRNAs转录本行qRT-PCR方法验证，证实测序结果真实、可靠。
　　3.生物信息学（GO富集）分析表明差异表达的基因转录本主要参与了心脏发育、离子转运及细胞黏附等生物学过程;基于表达量变化≥2倍的转录本筛选、靶基因预测、共表达分析、预测靶基因的生物学功能分析、组织表达特异性鉴定、保守性分析等一系列统计学和生物信息学方法，筛选出3个与电重构相关的新lncRNAs转录本TCONS_00106987、XR_516397、TCONS_00075467，其中TCONS_00106987表达上调，XR_516397、TCONS_00075467表达下调。并选取TCONS_00075467作为目标lncRNA行进一步深入的机制研究。
　　4.对目标lncRNA TCONS_00075467行功能沉默实验后，冷冻切片和细胞爬片观察荧光强度以确定感染效率，qRT-PCR检测表达水平，验证沉默效率。心内电生理检查表明，感染前及感染即刻的AERP不存在差异性变化;与阴性对照组比较，TCONS_00075467沉默组的AERP在感染7天后显著缩短，同时使阵发性房性心动过速及房颤易诱发。
　　5.TCONS_00075467位于兔基因组13号染色体正义链141223079-141225530区域(OryCun2.0)，该区域无编码基因覆盖，此转录本属于基因间lncRNA(lincRNA)，且不具备蛋白编码能力，主要分布在心房肌细胞的细胞质中。GO富集分析表明TCONS_00075467参与离子转运、心脏发育等生物学过程;KEGG分析表明其与钙离子信号通路、各种心肌病等生物学通路密切相关。
　　6.对于cis-机制，TCONS_00075467所在的基因组区域前后10kb范围内没有寻找到与房颤电重构或离子通道相关的基因转录本。根据生物信息学分析，转录本TCONS_00075467与ocu-miR-328存在多个结合位点，且其表达呈现明显负相关。行荧光素酶报告实验证实TCONS_00075467与ocu-miR-328间存在相互结合。TCONS_00075467沉默后ocu-miR-328的表达量上调。
　　7.Ocu-miR-328的在体沉默和过表达模型行心内电生理检查表明，ocu-miR-328的高表达能够显著缩短AERP，同时使阵发性房性心动过速及房颤易诱发;反之，ocu-miR-328的低表达可以延长AERP，使阵发性房性心动过速及房颤不易诱发。荧光素酶报告实验证实CACNA1C为ocu-miR-328的靶基因。ocu-miR-328高表达后呈现出CACNA1C的表达下调，同时ocu-miR-328的低表达使CACNA1C的表达上调。
　　8.TCONS_00075467低表达后出现CACNA1C的表达下调，同时能够使心房肌细胞的ICaL电流密度减弱和APD缩短。与TCONS_00075467沉默组相比，TCONS_00075467沉默慢病毒和ocu-miR-328沉默慢病毒的共感染使AERP明显延长，且阵发性房性心动过速及房颤的诱发率降低，CACNA1C的表达量上调;但与阴性对照组相比，共感染组的上述变化不具有统计学意义。
　　结论：
　　1.lncRNAs转录本在实验性房颤兔模型心房内具有显著性差异表达，差异表达的lncRNAs参与了房颤心房电重构的发生;
　　2.全新lncRNA转录本TCONS_00075467与房颤电重构密切相关，且通过功能沉默实验明确了TCONS_00075467在房颤诱发中的作用;
　　3.TCONS_00075467在体内和体外均能竞争性结合ocu-miR-328进而调控下游靶基因CACNA1C的表达，且ocu-miR-328能够部分逆转TCONS_00075467在电重构中的作用。
　　创新性：
　　1.基于敲低实验的功能沉默，明确lncRNAs表达量变化对心房电重构和房颤发生的影响;
　　2.探索lncRNAs通过内源竞争性结合机制调控靶基因影响房颤心房电重构的分子机制，有助于推动lncRNAs在房颤发生机制中的研究;
　　3.基于慢病毒介导的lncRNA沉默载体在体和体外感染，借助于心内电生理检查和膜片钳技术，阐释lncRNAs在心房电重构中发挥作用的机制。

目录

声明

摘要

符号说明(Symbols)

第一部分 心房颤动兔心房肌lncRNAs表达谱变化及电重构相关lncRNAs的鉴定

前言

材料与方法

结果

讨论

创新性

小结

附表

附图

参考文献

第二部分 TCONS_00075467对房颤心房电重构的影响及机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

创新性

小结

附图

参考文献

致谢

攻读学位期间论文发表情况和课题题目

学位论文评阅及答辩情况表

英文论文Ⅰ

英文论文Ⅱ