胃癌中HRCT1异常表达及其促进胃癌转移及增殖的研究

摘要

目的： 胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，复发率高，易转移，预后较差，已成为危害人类健康的重要疾病。引起胃癌患者死亡的主要原因是癌组织的浸润和远处转移。胃癌的浸润转移是一个涉及到多基因、多通路参与的复杂过程，目前其分子调控机制尚未完全阐明，因此如何在错综复杂的信号通路中寻找有价值的分子治疗靶点，并应用于临床治疗就显得尤为重要，目前也是该领域研究的热点之一。 本课题应用mRNA高通量表达谱芯片技术，通过比较并分析胃癌转移组和非转移组的差异表达基因，最终选择了HRCT1作为本课题研究对象。目前，文献中关于HRCT1基因的报道罕见，对于其在肿瘤组织中表达及功能学研究未见有明确的报道。我们的前期研究发现，相对于胃癌非转移组，HRCT1在胃癌转移组中的表达明显上调，提示HRCT1可能和胃癌的浸润转移相关。在后继的实验中，我们首先检测了HRCTI在胃癌中的表达情况，并对其与临床病理参数及预后的关系进行了分析;然后应用Transwell小室、MTS、EDU及基因芯片等技术，对HRCT1促进胃癌浸润、转移及增殖的功能和机制做了详细研究。miRNAs是一类短链且非编码RNA，它们通过与靶基因的3'UTR区结合，抑制靶基因的mRNA表达或抑制靶蛋白的翻译。为了研究HRCT1上游是否受miRNAs调控，我们应用软件并结合文献报道筛选了可能作用于HRCT1的miRNAs，经过双荧光素酶报告基因实验和Westernblot实验的验证，最终筛选出miRNA-124可下调HRCT1的表达。 方法： 1.mRNA高通量表达谱芯片筛选差异表达基因。收集新鲜胃癌标本，包括5例伴有淋巴结转移的和5例无淋巴结转移的胃癌标本，进行高通量基因芯片检测，按照上调变化比值≧2同时满足P＜0.05的标准进行筛选。 2.RT-qPCR检测基因mRNA的表达。将收集的胃癌新鲜组织或是胃癌细胞样本，应用实时荧光定量PCR方法(RT-qPCR)检测各样本中基因表达情况。 3.HRCT1蛋白表达的检测。应用免疫组织化学(IHC)技术检测胃癌石蜡标本中HRCT1蛋白的表达情况;应用Westernblot技术检测胃癌细胞系中转染HRCT1过表达载体或si-HRCT1（HRCT1干扰序列）后蛋白的表达情况。 4.胃癌细胞迁移和浸润能力检测。胃癌细胞系转染HRCT1过表达载体或si-HRCT1，Transwell小室实验用于检测胃癌细胞的迁移和浸润能力。 5.胃癌细胞增殖功能检测。胃癌细胞系转染HRCT1过表达载体或si-HRCT1转染，MTS和EDU实验用于检测胃癌细胞的增殖能力。 6.荷瘤裸鼠实验检测胃癌细胞在体内浸润、转移及增殖功能。将稳定过表达HRCT1的胃癌细胞通过腋窝皮下注射和尾静脉注射注入裸鼠体内。之后5周后观察胃癌细胞远处脏器转移情况和皮下瘤体增殖及浸润情况。 7.HRCT1下游信号通路的筛选和验证。收集过表达HRCT1基因及对照组的BGC823胃癌细胞进行mRNA基因表达谱检测，通过分析差异表达基因，筛选受HRCT1调控的下游信号通路，并应用RT-qPCR及Westernblot技术从mRNA和蛋白水平进行验证。 8.HRCT1上游miRNA的预测与验证。通过软件预测可能与HRCT13'UTR区域结合的miRNAs，应用双荧光素酶报告基因实验和Westernblot实验进一步筛选具体调控HRCT1上游的miRNA。 9.统计学分析。两组计数资料数据的比较采用Student t-test（t检验）的检验方法;两组计量资料数据的差异采用卡方检验方法，Kaplan-Meier和Cox回归检验法分析HRCT1蛋白表达与胃癌患者术后生存的关系。P＜0.05有统计学意义。 结果： 1.收集新鲜胃癌标本10例，包括5例伴淋巴结转移的胃癌标本和5例无淋巴结转移的胃癌标本，进行mRNA基因表达谱检测。芯片结果显示1150个差异表达基因（包括700个显著下调的基因和450个显著上调的基因）。后经调高筛选标准及结合文献报道，最终在差异最为显著的30个基因中选择HRCT1作为研究对象。 2.应用RT-qPCR技术在55例新鲜胃癌组织和27例新鲜非肿瘤粘膜组织中检测了HRCTlmRNA的表达情况，结果显示:HRCTlmRNA在胃癌组织中的表达明显高于非肿瘤粘膜组织;在35例伴有淋巴结转移的新鲜胃癌组织中的表达明显高于20例无淋巴结转移的新鲜胃癌组织，与芯片结果相符。此外，应用RT-qPCR技术还检测了BGC823，SGC7901，AGS和MKN45各胃癌细胞系中HRCTlmRNA的表达情况，结果显示，在分化差、转移性强的BGC823和SGC7901胃癌细胞系中的表达明显高于侵袭性相对较弱的AGS和MKN45细胞系。 3.应用免疫组织化学技术在139例胃癌石蜡标本和51例非肿瘤粘膜标本内检测了HRCT1蛋白的表达情况，结果显示:HRCT1蛋白主要表达于胃癌细胞的胞浆;HRCT1蛋白在胃癌组织中的表达明显高于非肿瘤粘膜;在90例伴有淋巴结转移的胃癌组织中的表达明显高于49例无淋巴结转移组织。此外HRCT1蛋白还在有远处脏器转移组、较高临床分期组、侵及浆膜和浆膜外组及低分化组表达显著上调，而与年龄、性别、肿瘤大小等临床病理参数无关;相对HRCT1蛋白低表达的患者，高表达患者具有更差的临床预后。 4.应用Transwell小室技术对体外胃癌细胞系转染HRCT1过表达载体或有小干扰序列后其迁移和浸润能力进行检测，实验结果显示，BGC823和SGC7901细胞系过表达HRCT1后，其迁移和浸润能力明显增加;干扰HRCT1后，其迁移和浸润能力明显减弱;应用慢病毒载体感染BGC823细胞系，转入裸鼠体内构建动物模型，于动物体内检测HRCT1对肿瘤浸润和转移的功能的影响，实验结果显示:相对于对照组，HRCT1不但能明显促进裸鼠体皮下肿瘤组织浸润周边包膜及肌肉组织，而且促进肿瘤细胞向远处脏器转移，表现为肺内转移灶数目明显增多。 5.应用MTS和EDU技术对体外胃癌细胞系转染HRCT1过表达载体或小干扰序列后其增殖能力进行检测，实验结果显示BGC823和SGC7901细胞系过表达HRCT1后，其增殖能力明显增加;干扰HRCT1后增殖能力明显减弱;应用慢病毒载体感染BGC823细胞系，转入裸鼠体内构建动物模型，于动物体内检测HRCT1对肿瘤增殖功能的影响，实验结果显示:HRCT1在裸鼠体内明显促进胃癌细胞的增殖，表现为肿瘤生长速度的加快及体积的增大。 6.将BGC823细胞系过表达HRCT1后进行mRNA基因表达谱芯片检测，结果提示过表达HRCT1后能够明显上调HER2-MAPK信号通路的活性。后继的RT-qPCR及Westernblot实验结果证明，无论在mRNA水平还是蛋白水平，BGC823和SGC7901胃癌细胞内过表达HRCT1后均能明显上调HER2-MAPK信号通路的表达，干扰HRCT1后，可抑制HER2-MAPK信号通路的表达。 7.应用软件（Targetscan，miRWalk）预测可能与HRCT13'UTR区相结合的miRNAs，综合miRNA功能及文献查阅筛选出miR-124，miR-506，miR-199a-5p以及miR-505-3p等多个miRNAs。双荧光素酶报告基因实验表面miR-124能够明显下调HRCT1的表达;Westernblot实验进一步证实HRCT1蛋白的表达能明显被miR-124的负向调控。 结论： 1.HRCT1在胃癌中的表达明显高于非肿瘤粘膜，在伴有淋巴结转移的胃癌组织中的表达明显高于无淋巴结转移的胃癌组织;在分化差、侵袭性强的BGC823、SGC7901细胞系中的表达明显高于侵袭性相对弱的AGS、MKN45细胞系。 2.HRCT1蛋白在有远处脏器转移、较高的临床分期、侵达浆膜和浆膜外及低分化的胃癌组织中表达明显上调，而与年龄、性别、肿瘤的大小等相关临床病理参数无相关性;HRCT1蛋白高表达的胃癌患者预示较差的临床预后;HRCT1蛋白表达量的高低是胃癌患者总体生存和无瘤生存的独立预后因素。 3.HRCT1在体内及体外均可促进胃癌细胞的浸润、转移及增殖。 4.HRCT1在胃癌细胞内可明显上调HER2-MAPK信号通路的活性，进而增强胃癌细胞的浸润、转移和增殖能力。 5.HRCT1在胃癌细胞内可受miR-124的负向调控。

目录

声明

符号说明

前言

材料和方法

1．试剂及仪器设备

2．组织标本及胃癌细胞系

3．胃癌新鲜组织及胃癌细胞系总RNA的提取

4．总RNA反转录和实时荧光定量PCR

5．基因芯片

6．细胞培养

7．载体构建

8．细胞功能学实验

9．免疫组织化学

10．Westernblot

11．荷瘤裸鼠体内实验

12．双荧光素酶报告基因实验

13．统计学检测方法

结果

1．HRCT1在胃癌组织中的表达

2．HRCT1促进一癌细胞的迁移与浸润

3．HRCT1促进胃癌细胞增殖

4．HRCT1通过上调HER2-MAPK信号通路促进肿瘤的浸润、转移

5．miR-124可负向调控HRCT1的表达

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文

英文论文1

英文论文2