富含nHA并缓释NELL--1蛋白的纳米纤维支架构建及其体外生物活性研究

摘要

目的: (1)构建负载NELL-1蛋白的纳米微球，形成生长因子释放的第一层屏障，检测微球的材料表征、生长因子体外释放及体外生物活性。 (2)制备富含纳米羟基磷灰石的PCL复合纤维支架材料，赋予材料骨传导性，检测和评价不同nHA含量的复合支架材料的理化表征、生物相容性并探讨复合支架材料对MC3T3-E1前体成骨细胞黏附、增殖、分化及成骨相关基因(RUNX2、OPN、COL1)表达的影响。 (3)构建富含纳米羟基磷灰石并缓释NELL-1蛋白的复合纤维支架材料，形成生长因子释放的双层保护屏障，赋予纳米纤维支架骨传导性和骨诱导性，评价支架材料的理化表征及生物相容性，并检测复合支架材料中NELL-1蛋白的缓释效果，探讨复合支架材料对MC3T3-E1前体成骨细胞黏附生长、增殖、分化及成骨相关基因(RUNX2、OPN、COL1)表达的影响。 方法: (1)首先采用去溶剂法及自组装技术制备负载NELL-1的壳聚糖纳米微球(Chi/NNPs)，采用透射电镜、纳米粒度仪、ART-FTIR、CLSM检测微球的材料表征，用NELL-1Elisa Kit检测微球的包封率及体外蛋白释放，通过检测小鼠成骨细胞碱性磷酸酶表达评价释放NELL-1的生物活性。 (2)采用静电纺丝技术将不同质量的纳米羟基磷灰石与PCL制备成复合纤维支架材料，通过SEM、TEM、拉伸强度检测、ART-FTIR、接触角仪及亲水率检测等评价复合支架材料的表征，用CCK-8试剂盒及CLSM检测评价支架材料上MC3T3-E1粘附生长及材料毒性情况，采用茜素红染色、ALP试剂盒及RT-PCR检测不同复合支架材料对MC3T3-E1细胞成骨向分化、矿化的影响。 (3)采用静电纺丝技术将Chi/NNPs及nHA嵌入聚己内酯复合纤维支架，通过SEM、TEM、拉伸强度检测、接触角仪及亲水率检测评估材料的表征，NELL-1Elisa Kit检测复合支架材料体外释放NELL-1的缓释效果，采用CCK-8试剂盒、CLSM、SEM检测评估MC3T3-E1细胞在复合材料粘附生长、粘附伸展及材料的毒性情况，采用ALP试剂盒及RT-PCR评价不同复合支架材料对MC3T3-E1细胞成骨向分化、矿化的影响。 结果: (1)第一部分实验: TEM结果显示，Chi/NNPs与Chi/BNPs可形成纳米微球结构，表面具有明显的被壳聚糖包被的图像，形态稳定，呈球形、光滑、无团聚。ART-FTIR显示壳聚糖、BSA蛋白的光谱特征峰可以在壳聚糖纳米微球的光谱中观察到。CLSM镜下可见壳聚糖包被的纳米颗粒均匀分散在玻璃片上，没有明显的团聚，绿色荧光颜色在纳米颗粒上的均匀分布表明壳聚糖在BSA颗粒上均匀分布。粒径结果显示Chi/BNPs粒径为378.726±13.140nm、Chi/NNPs(0.075％、0.15％、0.3％)粒径分别为368.663±15.470nm、382.881±18.767nm、390.480±11.465nm，这四组的粒径无差异但均比BSA凝聚体的直径大，且有统计学意义(P＜0.05)。Chi/BNPs各组的PDI值为0.378±0.029、Chi/NNPs(0.075％、0.15％、0.3％)组分别为0.379±0.017、0.388±0.039、0.462±0.030，均小于0.5，而BNPs的PDI值为0.669±0.072。Chi/NNPs(0.075％、0.15％、0.3％)的zeta电位分别+25.03±1.42mV、+30.27±1.80mV、+31.03±2.05mV,Chi/BNPs及BNPs的zeta电位为+29.03.03±2.15mV、+23.067±2.54mV。Chi/NNPs(0.075％、0.15％、0.3％)包封率分别为88.50±3.63％、89.30±3.82％、87.83±3.50％，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05)。体外累计释放曲线显示NELL-1可以持续释放192h以上，释放初期突释不明显，在0.15％壳聚糖组和0.3％壳聚糖组之间存在相似的释放曲线，两者之间差异无统计学意义。与新鲜NELL-1溶液相比，从Chi/NNPs(0.15％)0～2d释放的NELL-1的ALP活性分别为93.18±8.99％、3～5d为85.35±5.84％、6～8d为82.67±8.74％。统计分析显示，在整个释放期间，从Chi/NNPs释放的NELL-1的生物活性高于阴性对照组(Chi/BNPs)(P＜0.05)。新鲜NELL-1溶液的生物活性高于其他三组释放的NELL-1溶液，但统计学无差异(P＞0.05)。 (2)第二部分实验: SEM镜下可见制备的纤维支架呈现无序的三维交错结构，纤维与纤维之间交错成网状。PCL组、PCL+10％nHA组、PCL+20％nHA组、PCL+30％nHA、PCL+40％nHA组的纤维直径分别为550.90±37.43nm、572.44±35.27nm、581.38±40.58nm、617.18±30.17nm、630.02±60.53nm。TEM显示纯PCL表面光滑，而富含nHA的PCL组表面略显粗糙，且可观察到纤维内部有较多的nHA的排列聚集，尤其以PCL+30％nHA组及PCL+40％nHA组效果显著，且其表面的粗糙程度更明显。ART-FTIR结果显示nHA的代表性官能团主要有OH-1、PO43-，纯PCL的主要官能团有C=O、C-H、C-O等，在不同含量的nHA的PCL中，可以发现含有nHA及PCL的主要官能团，可见在静电纺丝制作过程中PCL可将nHA嵌入其中且PCL和nHA的结构成分未发生明显变化。拉伸强度结果显示PCL组强度最高，达到14.98±1.13MPa。随加入nHA量的增加，富含nHA的PCL拉伸强度逐渐降低。PCL+40％nHA组拉伸强度最低，低至6.02±0.98MPa。接触角检测可见PCL的接触角较大，随着nHA加入量的增加，复合支架材料接触角明显减小，PCL+30％nHA组、PCL+40％nHA组的亲水性明显提高。进一步的吸水率检测结果表明，随nHA加入量的增加，材料的吸水率明显增加，PCL+30％nHA组、PCL+40％nHA组的吸水率明显高于PCL组且差异有统计学意义。CLSM结果显示随着PCL中加入nHA量的变化，细胞粘附数量明显增加，细胞在PCL+30％nHA组、PCL+40％nHA组的数量最多，即PCL中引入羟基磷灰石能够明显促进细胞的粘附伸展。CCK-8的结果表明nHA加入PCL可明显提高MC3T3-E1细胞在支架表面的生长增殖，即nHA嵌入的复合支架材料是没有毒性的。茜素红染色的实验结果表明随nHA含量的增加，矿化作用愈明显，可见纤维支架上具有更多的钙盐沉积，PCL+30％nHA、PCL+40％nHA纤维支架上的钙结节数量和大小明显高于纯PCL纤维支架。 结论: (1)壳聚糖成功包被在BSA凝聚体表面形成纳米微球，其形态稳定，呈球形、光滑、无团聚，粒径适中，具有较高的包封率，可形成生长因子释放的保护屏障进而较好的缓释NELL-1蛋白的释放，且释放的NELL-1具有较高的生物活性。这为生长因子在组织再生的应用提供了新的载药和缓释方式，从而可为骨组织再生提供负载生长因子的生物活性材料，为骨缺损修复的研究奠定基础。 (2)nHA嵌入的PCL复合支架材料具有具有三维交联的结构、纤维直径分布较均匀、形态较一致，具有较好的亲水性、较好的拉伸强度（PCL+40nHA组除外）、良好的生物相容性，nHA高含量的复合纤维支架（PCL+30％nHA组及PCL+40％nHA组）更有利于MC3T3-E1细胞的粘附生长增殖，显著促进MC3T3-E1细胞ALP及成骨相关基因(RUNX2、OPN、COL1)mRNA的表达，可明显促进MC3T3-E1细胞的成骨向分化成熟及矿化。综合材料表征及生物活性，PCL+30％nHA组既具有良好的三维结构、较强的亲水性及适宜的机械强度，又具有明显的促进促进MC3T3-E1细胞粘附生长、增殖及成骨向分化，是较理想的富含纳米级生物陶瓷的聚合物复合材料，这可为骨缺损的修复提供新的支架材料。 (3)nHA及NELL-1微球嵌入的PCL纤维支架三维交错成网状、nHA及微球成功包裹于PCL纤维中，具有良好的润湿性、拉伸强度及生物相容性，可明显促进MC3T3-E1细胞在支架的粘附生长增殖。壳聚糖微球和PCL纤维支架为NELL-1的释放形成双层保护屏障，可有效的延长生长因子的释放时间，释放的NELL-1蛋白可提高ALP的表达说明释放的生长因子保持有良好的生物活性。nHA及NELL-1微球嵌入的PCL纤维支架促进MC3T3-E1细胞成骨相关基因(RUNX2、OPN、COL1)的表达，促进MC3T3-E1细胞成骨向分化成熟，构建的复合纤维具有良好的成骨活性，这可为骨缺损的修复提供较理想的支架材料。

目录

声明

摘要

符号说明

研究背景

参考文献

第一部分负载NELL-1蛋白的壳聚糖纳米微球的制备及其生物活性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分富含纳米羟基磷灰石的PCL纤维支架构建及体外生物活性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分负载nHA并缓释NELL-1蛋白纤维支架的构建及体外生物活性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文总结

致谢

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