焦谷氨酰脯氨酸三环锡酯（PPC）诱导人肺腺癌细胞凋亡及其机制研究

摘要

肺癌是一种严重威胁人类健康和生命的疾病，在我国肺癌的发病率与死亡率高居榜首。在所有的肺癌疾病中，肺腺癌最常见，然而迄今为止，肺腺癌细胞凋亡的分子机制还不清楚，影响了肺腺癌的有效治疗，所以，阐明肺腺癌细胞凋亡分子机制对治疗肺癌具有十分重要的意义。 由于肺腺癌患者发现时多为晚期，所以在多种治疗肺腺癌的方法中，化疗就成为治疗肺腺癌最为有效的方法。因此，寻找有效杀伤肺腺癌细胞的化疗药物已成为研究者当前的主要任务之一。因此，我们通过研究有机锡小分子化合物诱导肺腺癌细胞凋亡，来研究肺腺癌细胞凋亡的分子机制。 目的：观察有机锡小分子化合物焦谷氨酰脯氨酸三环锡酯(PPC)对体外培养的人肺腺癌细胞系A549的生长抑制作用及其凋亡的分子机制，以期在细胞水平上为治疗肺腺癌提供理论依据。 方法：在体外培养的人肺腺癌细胞A549中，加入不同浓度的PPC，用MTT法检测细胞存活率，由此对小分子化合物进行初步筛选。在体外培养的上述肿瘤细胞中，加入不同浓度的PPC，动态观察细胞形态变化；分别采用Hoechest33258染色法、TUNEL法、LDH检测法，对细胞凋亡进行检测；采用western bolt检测细胞p53蛋白水平变化；采用流式细胞术分析PPC对肿瘤细胞的细胞周期的影响；采用荧光探针结合激光共聚焦显微镜技术分析细胞内Ca2+浓度变化。 结果：MTT法检测细胞存活率结果显示在48h内，PPC从0.1 μM开始显著降低细胞存活率(p<0.01，n=6)，并呈现明显的剂量效应。细胞凋亡检测发现：0.25μM，0.5μM处理A549细胞48小时，细胞形态变长，膜泡化，产生凋亡小体，并从皿底脱落死亡；通过Hoechest33258染色发现，0.25μM，0.5μM处理A549细胞48小时，发现染色质凝集，并产生凋亡小体；DNA的片断化检测发现，0.5μM处理A549细胞48小时，细胞呈现DNA和核的片断化；LDH活性检测显示0.25μM处理A549细胞48小时，与对照组相比，培养液中酶活变化不显著(P>0.05，n=3)，而0.5μM变化显著(P<0.01，n=3)。P53蛋白表达测定显示，0.5μM PPC可使A549细胞P53蛋白水平明显上调。分析DNA变化发现，0.5μM PPC可将A549细胞阻滞在G1期，不能向S期进展，且呈明显的时间依赖性。钙离子荧光探针检测发现，0.5μM PPC可使A549细胞内钙离子浓度显著增高(P<0.05或P<0.01，n=3)，且呈明显的时间依赖性。 结论：1、焦谷氨酰脯氨酸三环锡酯可以抑制A549细胞增殖。2、焦谷氨酰脯氨酸三环锡酯引起的A549细胞死亡方式以凋亡为主。3、焦谷氨酰脯氨酸三环锡酯对A549细胞周期的影响与时间有关，使细胞周期阻滞在G1期。4、焦谷氨酰脯氨酸三环锡酯可能通过上调p53的表达和Ca2+浓度来传递凋亡信号。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:简写说明

声明

第一章前言

1.1研究背景

1.1.1肺癌概述

1.1.2细胞凋亡与细胞坏死

1.1.3细胞凋亡信号通路

1.1.4细胞周期与抗肿瘤药物的相关性

1.1.5 p53

1.1.6钙离子与细胞凋亡

1.1.7有机锡小分子化合物抗肿瘤研究进展

1.2实验目的及意义

第二章实验操作

2.1实验材料

2.1.1细胞系

2.1.2抗肿瘤药物

2.1.3主要试剂：

2.1.4主要仪器

2.1.5主要工作液配方

2.2实验方法

2.2.1 A549细胞复苏及培养

2.2.2 A549细胞传代

2.2.3MTT检测细胞存活率

2.2.4倒置显微镜观察细胞形态

2.2.5 Hoechst33258染色实验

2.2.6乳酸脱氢酶试盒检测药物的细胞毒性

2.2.7 TUNEL法检测细胞凋亡实验

2.2.8流式细胞仪检测细胞周期

2.2.9细胞总蛋白的提取

2.2.10 Westernblot检测p53蛋白表达

2.2.11Ca2+浓度

2.3数据处理

第三章实验结果及讨论

3.1实验结果：

3.1.1 MTT检测细胞存活率

3.1.2化合物对细胞形态学的影响

3.1.3 H33258染色结果

3.1.4 LDH检测细胞膜完整性

3.1.5细胞DNA片断化检测

3.1.6对细胞周期分布影响

3.1.7 Westernblot检测p53蛋白表达

3.1.8钙离子浓度

3.2讨论

3.2.1有机锡小分子化合物的抗肿瘤作用

3.2.2小分子化合物对p53蛋白表达水平的影响

3.2.3小分子化合物对Ca2+浓度的影响

3.3结论

参考文献

致谢