大仓鼠SSR座位的筛选及黑线仓鼠MHC基因的克隆与序列分析

摘要

大仓鼠(Tscherskia triton)和黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)在我国分布范围广，繁殖力极强，是危害农业、传播疾病的有害动物，因此本论文主要针对这两类害鼠展开分子生物学方面的研究。 微卫星是一种较好的分子遗传标记，在种群进化研究、种群结构分析、遗传多样性等研究中得到了广泛的应用。大仓鼠(Tscherskia triton)是广泛分布于我国长江以北的重要害鼠之一。过去关于大仓鼠微卫星座位的筛选、利用其进行遗传多样性研究的报道较少。研究一使用经典的酚/氯仿抽提法从保存于-70℃的肝脏组织中提纯北京顺义、河北固安、饶阳等地区大仓鼠的基因组DNA，并利用大仓鼠近缘种-原仓鼠(Cricetus cricetus)、金仓鼠(Mesocricetus auratus)和黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)的10对微卫星引物(LOC-1至LOC-6；SSR1至ssrf11)，通过PCR扩增筛选大仓鼠的微卫星座位，并对可能含有微卫星的阳性克隆进行测序，最终得到33个微卫星序列。利用BLAST序列分析软件对GenBank数据库进行检索，没有找到同源性一致的相应微卫星序列，表明33个大仓鼠微卫星序列都是首次发现的。注册序列的GenBank登陆号为EF690673～EF690693，EU140825～EU140836。这些微卫星序列可以分成三类：完美型占39.4％，非完美型占24.2％，复合型占36.4％。另外可见重复次数在8～20的微卫星序列最多，占60.6％，重复次数在21次以上的占39.4％。大部分微卫星序列的二核苷酸重复次数均在12以上，可以进行后续大仓鼠微卫星引物设计和相应的种群多态性分析。 主要组织相容性复合体(MHC)是由紧密连锁、高度多态的基因位点所组成的染色体上的一个区域，MHC基因具有高度多态性，对于维持种属的生存与延续具有重要的生物学意义。MHC的突出特性及其重要的功能使其在免疫遗传学、群体遗传学和抗病育种学等领域具有独特的效力。 研究二应用MHCⅠ类基因来探讨黑线仓鼠种群间的遗传结构，寻找分子遗传标记。根据已报道的四个黑线仓鼠MHCⅠ类基因序列以及人、大鼠和小鼠的相应序列，设计了一对特异性引物(SS1)，从临沂沂南、潍坊临朐及曲阜吴村三个种群的黑线仓鼠基因组DNA中扩增了编码MHCⅠ类α2结构域的基因片段，并进行测序，得到的GenBank序列登录号为：FJ619112～FJ619183。结果表明：(1)黑线仓鼠MHCⅠ类α2结构域的序列多态性较为丰富，255 bp长度中有41个多态位点，多态位点百分率为16.08％；(2)群体间遗传多样性存在差异：多态位点百分率为吴村(14.51％)>临朐(13.73％)>沂南(12.55％)；核苷酸多样性指数(Pi)为临朐(0.05278)>吴村(0.05097)>沂南(0.04884)；平均核苷酸差异数目(K)值为临朐(13.458)>吴村(12.998)>沂南(12.454)；单倍型多样性指数(Hd)都很高，说明编码MHCⅠ类分子α2结构域基因的核苷酸序列的变异较大；基于单个多态位点的群体动态的遗传参数(θω)值则为吴村(0.03575)>临朐(0.03436)>沂南(0.03026)；(3)三个地理种群的氨基酸序列中均存在与抗原多肽结合的位点，且极其保守，序列编码区的蛋白质预测图均包含α螺旋和β折叠，吴村种群α螺旋略有差异；(4)种群间的遗传分化指数接近，单倍型出现交叉，说明三个种群间的遗传分化不明显；(5)多态性丰富的编码MHCⅠ类分子α2结构域的基因序列，适宜作为黑线仓鼠不同群体的分子遗传标记。 研究三对MHCⅡ类DQA基因的外显子2进行克隆和序列分析。提取黑线仓鼠3个群体(吴村、沂南和临朐)的基因组DNA构建基因池，利用PCR扩增得到249 bp的目的片段，将该目的片段连接到pMD18-T载体中，重组质粒转入大肠杆菌DH5α后利用蓝白斑法筛选阳性克隆，测序后得到该目的片段的核苷酸序列(GenBank登录号：FJ209306)并推导出氨基酸序列。结果表明：黑线仓鼠、人、大鼠、小鼠、猪、马、牛、兔之间DQA基因外显子2的核苷酸序列同源性为68.7％～85％，氨基酸序列同源性为56.8％～83.5％，黑线仓鼠与大鼠、小鼠亲缘关系更近。测序得到的DQA基因外显子2序列具有丰富的种间多态性，可以作为物种遗传分析的分子标记。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.文献综述

1.1大仓鼠的研究进展

1.2分子标记及微卫星的研究进展

1.3黑线仓鼠的研究进展

1.4 MHC的研究进展

1.4.1 MHC的结构与遗传特征

1.4.2 MHC的生物学功能

1.4.3 MHC的研究现状

1.5本研究的目的和意义

2.实验研究

2.1研究一大仓鼠SSR座位的筛选

2.1.1引言

2.1.2材料与方法

2.1.3结果与分析

2.1.4讨论

2.2研究二黑线仓鼠群体间编码MHCⅠ类分子α2结构域基因的克隆与多态性分析

2.2.1引言

2.2.2材料与方法

2.2.3结果与分析

2.2.4 讨论

2.3研究三黑线仓鼠MHC Ⅱ类DQA基因外显子2的克隆与序列分析

2.3.1引言

2.3.2材料与方法

2.3.3结果与分析

2.3.4 讨论

2.3.5结论

参考文献

读研期间发表的论文

致谢