基于微卫星和线粒体基因的中国西北地区狼的分子生态学研究

摘要

狼(Canis lupus)曾广泛分布在亚欧大陆和北美地区，是现存的最大的犬科动物。在我国，狼目前主要分布在新疆、西藏、青海、内蒙、四川西部和云南西北部等人口密度较小的偏远地区，而且呈现片段化分布。由于人类的干扰和栖息地的破坏，狼的生存现状越来越令人担忧，也受到越来越多的关注。
　　本研究使用14对微卫星引物对内蒙、蒙古、新疆、青海和西藏5个地理种群的80个狼个体进行分析，同时对5个地理种群的74个狼个体的线粒体DNA的控制区（D-loop）和细胞色素b（Cytb）的部分序列进行系统分析。采用微卫星DNA和mtDNA两种不同的分子标记探讨5个地理种群狼的分子生态学问题。主要结果如下：
　　1.筛选14对微卫星位点分析狼的5个地理种群的遗传多样性。结果显示，14个微卫星位点的等位基因的数目在5-20之间不等，平均为9.786个，多态信息含量PIC为0.740，各地理种群的等位基因数平均为5.6个，平期望杂合度0.6778，平均观察杂合度为0.6738。
　　2.对狼的5个地理种群狼的线粒体HVRI和Cytb的部分序列分析。结果显示，5个地理狼种群中共检测出D-loop基因单倍型20种，Cytb基因单倍型19种。平均核苷酸多样性为0.1084和0.0065，变异位点占序列长度的比例为7.90％和10.18％。
　　3.利用STRUCTURE软件的聚类结果，当K=2时，5个狼地理种群间的遗传结构最为清晰。根据STRUCTURE的结果，利用AMOVA软件对两个大居群的5个狼地理种群进行变异分析。结果显示，居群间的变异比例是11％，种群间的变异比例是5％，主要变异产生在种群内部，为84％。因此，中国西北地区的狼在各地理种群之间的遗传分化不显著，只是在两个居群之间存在一定的遗传分化。
　　4.利用微卫星与线粒体数据对狼的5个地理种群构建系统发生树，结果表现一致，即青海与西藏两个地理种群聚为一支，而新疆、蒙古和外蒙三个地理种群聚为一支。
　　5.根据Cytb基因分子钟原理，计算出5个地理种群狼的分歧时间，青海与西藏两个地理种群和新疆、内蒙和外蒙三个地理种群之间的分化时间在1.175-1.3MYA前。推断这一结果与青藏高原的隆起有关。
　　6.从保护遗传学的角度，我们建议将我国西北地区狼划分为蒙新区和青藏区两个ESUs进行研究和管理。

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第一章 综述

1.1分子标记

1.1.1线粒体

1.1.2微卫星（microsatellite）

1.2狼的研究综述

1.2.1狼的形态学研究

1.2.2狼的进化以及与家犬的关系

1.2.3狼的分布与现状

1.2.4中国狼的分布与分类

1.3 本研究的目的和意义

第二章 基于微卫星标记分析5个狼地理种群

2.1材料、药品与仪器

2.1.1样品信息

2.1.2仪器与试剂

2.2试验方法

2.2.1总DNA的提取

2.2.2微卫星位点的初步筛选

2.2.3荧光引物设计与分组

2.2.4 PCR扩增体系与条件

2.3.5数据统计与分析方法

2.3微卫星DNA的结果与分析

2.3.1种群的遗传变异

2.3.2种群间的遗传分化

2.3.3聚类分析

2.3.4不同地理种群间的遗传结构和分化

2.4讨论

2.4.1 5个地理种群狼的遗传多样性分析

2.4.2多态信息含量（PIC）

2.4.3等位基因数和基因杂合度

2.4.4种群间的遗传分化

2.4.5种群间的遗传结构与变异分析

第三章 基于线粒体基因分析5个狼地理种群

3.1材料、药品与仪器

3.2试验方法

3.2.1引物信息

3.2.2目的片段扩增的条件及体系

3.2.3凝胶电泳检测及PCR产物回收测序

3.2.4线粒体数据的处理与分析

3.3线粒体DNA的结果与分析

3.3.1线粒体基因D-loop的HVRI部分序列结果与分析

3.3.2线粒体基因cytb部分序列结果与分析

3.4讨论

3.4.1线粒体DNA序列的变异分析

3.4.2基于线粒体DNA 的遗传多样性

3.4.3狼的分子系统地理学

3.4.4两种分子标记分析结果的比较分析

3.4.5狼的保护与管理建议

第四章 结论与展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

在校期间发表的学术论文

致谢

附录