Pink1调控的线粒体自噬对多能性诱导和维持的影响

摘要

自噬是一个高度保守的生理过程，通过囊泡结构将细胞质内的组分进行隔离、包裹，进而与溶酶体融合降解。自噬作为细胞内一个主要的降解和回收途径，在个体发育过程和细胞稳态维持中都起到非常关键的作用。线粒体自噬是细胞内功能异常或者多余的线粒体通过自噬途径降解的过程，对于细胞内线粒体的质量控制发挥着重要作用。在细胞内线粒体主要通过产生ATP为细胞提供能量，但当线粒体受到损伤的时候，就会产生过多的压力信号，从而导致细胞损伤并且最终引起细胞程序性死亡的发生。因此，受损线粒体的识别和降解也是细胞体内稳态维持中非常重要的组成部分。
　　干细胞具有自我更新和多向分化潜能，在疾病模型建立、细胞治疗修复、再生医学方面，有着广阔的应用前景。线粒体作为多能干细胞重要的细胞器，其质量控制和稳态维持对于多能性的影响还不是很清楚。这里我们研究了Pink1调控的线粒体自噬对多能性获得和多能性调控的影响。
　　我们发现多能干细胞中将线粒体自噬介导蛋白Pink1敲除能够引起多能干细胞中线粒体数量会发生积累，线粒体的膜电势降低，ATP产量降低，而细胞中ROS的含量增加。这些结果表明，当多能干细胞中Pink1介导的线粒体自噬缺失后，会导致多能干细胞中功能异常的线粒体发生积累。进一步，我们发现当敲除Pink1后，多能干细胞的自我更新能力显著降低。通过实时荧光定量PCR检测多能性基因的表达情况后发现，Pink1的缺失会显著降低多能性基因的表达，并且体内分化形成的畸胎瘤体积和重量均较野生型的小。
　　重编程过程中，我们发现Pink1敲减会导致细胞内线粒体不能有效清除，从而降低重编程效率。这些结果都表明了Pink1参与了多能性诱导和维持中的线粒体调控。
　　使用Parkin基因敲除的MEF细胞进行体细胞重编程并未发现重编程中线粒体的累积和重编程效率的降低，这些结果表明Pink1并不是通过激活Parkin而调控重编程及胚胎干细胞多能性的。未来的工作我们将筛选Pink1下游作用分子，进一步阐明Pink调控多能性的分子机理。

目录

声明

第一章 绪论

1.1.2 自噬与线粒体自噬在多能干细胞中的作用

1.2 文献综述

1.2.1 胚胎干细胞中的自噬研究

1.2.2 Pink1通过磷酸化泛素来激活Parkin

1.2.3 Pink1通过招募自噬受体来诱导线粒体自噬的发生

1.2.4 TBK1的磷酸化作用在线粒体自噬中的作用

1.2.5 TBK1通过磷酸化Optn促进受损线粒体选择性的自噬发生

第二章 材料与方法

2.1.3 主要细胞系

2.2实验方法

2.2.1相关基因的体外克隆1、PCR反应体系

2.2.2 shRNA干扰载体的构建

2.2.3细胞培养

2.2.4慢病毒包装（磷酸钙转染法）

2.2.5荧光实时定量PCR(Real-Time PCR)

2.2.6 碱性磷酸酶染色（6孔板为例）

2.2.8用Cas9进行基因敲除

2.2.9基因过表达ES系的建立

2.2.11 CFSE检测细胞增殖

第三章 实验结果

3.1.2 Pink1 knock down 后显著降低体细胞重编程效率

3.1.3 本节小结：

3.2.2 Cas9-gRNA 的构建

3.2.4单克隆酶切验证

3.2.6本节小结

3.3.2 Pink1基因敲除ES细胞系自我更新能力的检测

3.3.4 本节小结

3.4.1 Pink1基因敲除后ES线粒体数量及功能的变化

3.4.2 Pink1基因敲除ES细胞系增殖能力的检测

3.4.3 Pink1基因敲除ES细胞系凋亡的检测

3.5 经典Pink/Parkin信号通路对重编程及ES多能性的影响

3.5.2 Parkin 敲除后不影响ES多能性的维持及线粒体数量

3.5.3 本节小结

3.6线粒体自噬受体对重编程的影响

3.6.2 相关自噬受体敲降载体的慢病毒包装及感染

3.6.3 基因干扰效率检测

3.6.5 本节小结

第四章 结论

附录

参考文献

作者简历

致谢