旱地土壤氮循环过程及新型氮循环微生物的分布与活性

摘要

在地球生物循环中，氮元素是极其重要的营养元素，生物氮循环与碳循环联系紧密。近年来，厌氧氨氧化反应（anaerobic ammonium oxidation，anammox）和反硝化厌氧甲烷氧化反应(nitrite-dependent anaerobic methane oxidation，n-damo)等新型氮循环过程被发现，新的氮、碳循环理论体系不断完善。然而目前，人们对氮循环过程的了解还存在相当多的空缺。对厌氧氨氧化和反硝化厌氧甲烷氧化反应的研究也主要集中在水生态环境，关于其在旱地生态系统中的分布及作用研究较少。
　　因此，本论文综合利用分子生物学技术、环境理化因素分析与稳定同位素示踪法，对土壤氮循环进行分步过程探究，对新型氮循环微生物厌氧氨氧化菌、反硝化厌氧甲烷氧化菌在旱地土壤中的分布与活性进行了研究，并且对氮循环微生物（氨氧化古菌、氨氧化细菌、反硝化菌、厌氧氨氧化菌和反硝化厌氧甲烷氧化菌）之间的相互作用进行了探究。通过对不同类型旱地土壤样品的分析，得出以下结果:
　　在不同旱地土壤柱状样品中，好氧氨氧化速率(NH4+-NO2-)是亚硝酸盐氧化速率(NO2--NO3-)的0.16-124.93倍，硝化反应不应被看作单一的过程，而是作为好氧氨氧化反应和亚硝酸盐氧化反应两个独立的步骤。与硝化过程类似，反硝化过程中的硝酸盐还原反应(NO3--NO2-)和亚硝酸盐还原反应(NO2--N2)并不同步，同样是两个独立的步骤。另外，旱地土壤氮循环中NO2-来源差异较大，硝化过程和反硝化过程均可能主导氮循环，提供主要NO2-来源。消耗NO2-的四种氮循环过程（亚硝酸盐氧化、亚硝酸盐还原、厌氧氨氧化和硝酸盐异养还原反应）在不同类型旱地土壤中发挥的作用差异较大。
　　新型氮循环微生物厌氧氨氧化菌在旱地土壤中不仅数量较少(5.93×103-2.60×105 copies g-1)，其活性同样较低(0.002-0.52 nmol N g-1 h-1)。厌氧氨氧化反应在垂向土壤中的分布极不均匀，垂向土壤柱状样品中位于水位线附近的厌氧氨氧化菌活性最高，与丰度最大值出现的区域一致。临近水位线的厌氧氨氧化反应速率显著高于反硝化反应速率，主导土壤氮损失。此外，厌氧氨氧化菌NO2-来源由土壤氮循环的主导过程决定。硝化过程占主导时，好氧氨氧化反应为厌氧氨氧化菌提供NO2-底物;土壤氮循环由反硝化过程主导时，硝酸盐还原反应为厌氧氨氧化菌提供NO2-底物。
　　在北澧河旱地农业土壤中的研究中发现，厌氧氨氧化菌具有十分明显的时空异质性并且其生物多样性较高，‘Brocadia’、‘Kuenenia’和‘Jettenia’属均存在，其生物多样性在亚表层土壤中最高。反硝化厌氧甲烷氧化菌在旱地农业土壤中的时空异质性同样明显，但是其生物多样性较低。另外，反硝化厌氧甲烷氧化菌在旱地土壤中的垂向分布是不连续的，仅存在于土壤的某些深度。底物的缺乏以及与反硝化菌之间的竞争可能是导致反硝化厌氧甲烷氧化菌垂向不连续分布的重要原因。
　　旱地土壤中夏季厌氧氨氧化菌的数量（2.56×106-7.87×107copies g-1）高于冬季(2.77×105-1.06×107copies g-1);而反硝化厌氧甲烷氧化菌则是冬季数量较高，夏季其丰度值为1.44×104-1.28×106 copies g-1，而其冬季丰度值为4.48×104-4.62×106 copies g-1。
　　在北澧河旱地农业表层土壤中(0-20cm)，反硝化反应速率(NO2--N2)(1.23-2.73 nmol N g-1 h-1，85.0-99.0％)大于厌氧氨氧化反应速率(0.01-0.46 nmolN g-1 h-1，1.0-14.4％)和反硝化厌氧甲烷氧化反应速率(0.02 nmol N g-1h-1，0.6％)，由反硝化反应、厌氧氨氧化反应和反硝化厌氧甲烷氧化反应造成的氮损失分别为40.23-89.07 g N m-2yr-1、0.41-15.07 g N m-2yr-1和40.65 g N m-2yr-1，由反硝化反应主导土壤氮损失。然而在亚表层及深层土壤中(20-300 cm)，厌氧氨氧化反应速率(0.00005-0.18 nmol N g-1 h-1，51.4-89.5％)大于反硝化反应速率(0.00001-0.06 nmol N g-1 h-1，10.5-48.6％)，并且检测不到反硝化厌氧甲烷氧化反应的发生。由反硝化和厌氧氨氧化反应造成的氮损失分别为0.00028-1.88 g N m-2yr-1和0.0015-5.78g N m-2yr-1，土壤氮损失由厌氧氨氧化反应主导。
　　关于土壤氮循环分步过程及新型氮循环微生物的研究，改变了人们对氮循环的理解，提供了有关土壤氮负荷以及氮循环通量的新见解。新型氮循环过程作为一个关键的因素影响着全球氮循环模式，不断完善人们对氮平衡的理解。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 自然界的氮循环和温室效应现状

1．2 传统氮循环过程

1．2．1 固氮作用

1．2．2 细菌好氧氨氧化反应(aerobic ammonia oxidation)

1．2．3 好氧亚硝酸盐氧化反应(aerobic nitrite oxidation)

1．2．4 反硝化反应(denitrification)

1．2．5 硝酸盐异养还原反应(DNRA)

1．3 新型氮、碳循环过程

1．3．1 厌氧氨氧化反应在自然界的发现

1．3．2 厌氧氨氧化菌的分类及其反应机理

1．3．3 厌氧氨氧化菌生态学研究

1．3．4 反硝化厌氧甲烷氧化反应在自然界的发现

1．3．5 反硝化厌氧甲烷氧化微生物及其反应原理

1．3．6 反硝化厌氧甲烷氧化菌生态学研究现状

1．3．7 旱地生态系统中反硝化厌氧甲烷氧化反应发生的可能性

1．4 研究目标、内容与意义

1．4．1 研究目标

1．4．2 研究内容

1．4．3 研究意义

第2章 研究方法

2．1 样品采集与保存

2．2 样品理化指标分析方法

2．3 分子生物学方法

2．3．1 样品DNA提取

2．3．2 聚合酶链式反应

2．3．3 克隆、测序和构建系统发育树

2．3．4 定量PCR分析

2．4 15N稳定同位素示踪方法

2．5 13C稳定同位素示踪方法

第3章 旱地土壤氮循环分步过程速率与厌氧氨氧化菌的分布

3．1 引言

3．2 研究地点

3．3 研究结果

3．3．1 旱地垂向土壤传统氮循环过程的发生与反应速率

3．3．2 旱地垂向土壤新型氮循环厌氧氨氧化反应的速率与底物来源

3．3．3 旱地土壤氮循环主要过程的不同贡献

3．3．4 旱地土壤新型氮循环微生物厌氧氨氧化菌垂向分布特点与活性

3．4 本章结论

第4章 旱地土壤厌氧氨氧化菌和反硝化厌氧甲烷氧化菌的垂向分布特点与活性分析

4．1 引言

4．2 研究地点

4．3 研究结果

4．3．1 旱地垂向土壤厌氧氨氧化菌及相关微生物丰度

4．3．2 旱地垂向土壤厌氧氨氧化菌及相关微生物活性

4．3．3 旱地垂向土壤厌氧氨氧化菌生物多样性及群落结构分析

4．3．4 旱地垂向土壤反硝化厌氧甲烷氧化菌的分布特点与活性

4．3．5 旱地垂向土壤反硝化厌氧甲烷氧化菌菌多样性及群落结构分析

4．3．6 旱地土壤厌氧氨氧化反应和反硝化厌氧甲烷氧化反应底物来源

4．3．7 微生物反应对土壤氮和碳循环的影响

4．4 本章小结

第5章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间论文发表及科研情况

致谢