新型DNA/纳米粒子生物功能化探针在DNA和细胞检测中的应用

摘要

生物传感对于研究生物体内分子及细胞的结构和功能、生命活动的规律和本质、疾病的诊断、抗癌抗衰老等药物的设计、环境监测等都具有十分重要的意义。本文将DNA识别元件、适体识别元件与性能优良的纳米材料相结合，设计和研究了几种新型生物功能化探针，可用于癌细胞和靶DNA的特异性识别及检测。主要包括：
　　 1.设计了一种细胞外超分子网状DNA/量子点(QD)鞘膜探针，可用于癌细胞的高亮度的荧光成像。该超分子网状DNA/QD鞘膜是由修饰了Ramos细胞适体的DNA纳米线作为骨架，层层自组装大量的DNA/CdTe QD探针构建而成。其中，DNA纳米线骨架上负载的Ramos细胞适体可以特异性识别Ramos细胞并缠绕到细胞表面，同时，DNA纳米线骨架与DNA/CdTe QD探针发生多层自组装，形成超分子网状DNA/CdTe QD鞘膜，将细胞牢牢包裹于其中。由于该超分子网状DNA/QD鞘膜携带大量的荧光量子点，具有极高的荧光强度，是一种的生物相容性良好的荧光成像材料。对构建的DNA纳米线和超分子网状DNA/QD鞘膜进行了结构表征，并将该材料用于Ramos细胞的荧光成像，获得了高荧光亮度的细胞成像图。该材料也成功的应用于混合细胞系中Ramos细胞的识别，进一步证明了它良好的选择性。
　　 2.构建了一种新型的基于超分子网状DNA/CdTe QD鞘膜探针的电化学细胞传感器，可用于癌细胞的高灵敏高选择性定量检测。以Ramos细胞作为靶细胞，考察了方法的可行性。该电化学细胞传感器的构建原理为：将一端生物素修饰的Ramos适体固定到亲和素标记的聚苯乙烯微孔板上，由于适体对Ramos细胞具有很强的特异性识别能力，当加入细胞样品后，Ramos细胞被适体牢牢的固定在微孔板底部，再加入超分子网状DNA/CdTe QD鞘膜探针的合成原料，在细胞表面形成致密的超分子鞘膜探针。由于该超分子鞘膜是由DNA与CdTe QD发生多层自组装而成，负载了大量的CdTe QD标记物，具有显著的信号放大作用。将膜上的CdTe QD用稀酸溶解后得到Cd2+溶液，利用灵敏的差分脉冲阳极溶出伏安法(DPASV)对Cd2+进行定量检测。在优化的实验条件下，该电化学细胞生物传感器检测Ramos细胞的线性范围是10到1000个细胞，检测限为10个细胞。另外，该方法也成功的用于混合细胞系中Ramos细胞的检测，证明该方法不仅灵敏度高，还具有良好的选择性，具有潜在的应用价值。
　　 3.研制了一种新颖的信号放大型荧光探针，可用于癌细胞的高亮度荧光成像以及靶DNA的可视化检测。该探针以表面羧基化的聚苯乙烯微球为载体，共价结合DNA连接链，并以该连接链为起始端，自组装DNA纳米线/CdTe QD探针构建而成。由于DNA纳米线末端包含靶分子的识别序列，可特异性的与靶分子结合，确保探针的良好选择性；DNA纳米线中间部分含有大量的CdTe QD探针结合序列，可负载大量的荧光标记物，因此可产生显著的信号放大效应。本工作分别以细胞适体和靶DNA的互补序列为识别元件，构建了可用于癌细胞的高亮度荧光成像的功能化探针和靶DNA的可视化检测的探针。在癌细胞的荧光成像中_，该探针表现出了良好的特异性和荧光成像能力；在DNA的可视化检测中，利用这种探针可以直接观测到50 fM的靶DNA杂交反应。
　　 4.研制了一种新型一对一识别型三联金纳米粒子DNA探针，并构建了高灵敏的电化学DNA生物传感器。其工作原理为：在金电极表面固定巯基修饰的捕获DNA，之后分别与靶DNA和三联金纳米粒子DNA探针杂交，形成“三明治”式的DNA杂交复合物。探针上的三个金纳米粒子修饰了大量信号DNA，可以吸附大量的电化学指示剂[Ru(NH3)6]3+，利用计时电量法可实现靶DNA的电化学检测。该方法具有以下优点：一个三联金纳米粒子DNA探针只有一条靶DNA的识别链，因此可实现一对一的靶DNA识别和杂交，避免了传统DNA探针对靶DNA的消耗，提高了方法的灵敏度和选择性；三个金纳米粒子具有显著的信号放大效应，进一步提高了灵敏度。在优化的实验条件下，检测靶DNA的线性范围是1×10-16 M～1×10-14 M，检测限为53 aM(3σ)。此外，对两碱基错配DNA以及非互补DNA检测结果表明，该方法具有良好的选择性。综上所述，该电化学DNA传感器灵敏度高，选择性好且操作简便，具有潜在的应用价值。