纳米通道电化学单分子分析检测酶分子

摘要

单分子检测技术在分析领域的应用十分的广泛，本文主要是应用单分子检测技术研究酶的活性。本文的研究是基于溶血素纳米孔道的单分子电化学检测来讨论限制性核酸内切酶和凝血酶的活性。以溶血素通道为基础，将膜片钳放大技术与电化学检测技术相结合，实现限制性核酸内切酶和凝血酶单分子的检测及传感分析。利用核酸内切酶对特定位点的限制性内切以及凝血酶与凝血酶适体亲和作用的原理，设计了不同的特定的DNA链，通过观察分析限制性核酸内切酶或凝血酶作用于dsDNA后，DNA通过纳米孔道时的微电流变化，从而达到研究限制性核酸内切酶和凝血酶活性的目的。本论文共分为五章:
　　第一章，概述了纳米通道、核酸内切酶以及纳米粒子的简介及作用并简单介绍了单分子检测技术、凝胶电泳技术以及膜片钳放大检测技术等分析方法。着重对单分子检测技术和纳米通道进行了说明，对单分子检测技术的前景做了介绍。
　　第二章，采用单分子电化学检测初步研究了DNA测序工作，主要研究了限制性内切酶的活性。通过用溶血素和卵磷脂的自由组装形成生物纳米孔道，利用溶血素孔径的特性来控制单链DNA和双链DNA通过孔径时不同的电流下降，来初步对DNA测序工作进行了解。在限制性内切酶的作用下双链DNA能顺利的通过纳米孔道，通过对比限制性内切酶作用前后电流的变化进而对限制性内切酶的活性进行研究。
　　第三章，通过凝胶电泳技术和纳米金标记DNA在TEM下的图像来研究限制性核酸内切酶的活性，以及错配碱基T与T在Hg2+条件下能形成T-Hg-T的稳定存在。首先通过限制性内切酶作用前后的DNA在凝胶电泳下进行分离，观察分离的情况来研究限制性内切酶的，其次当DNA被纳米金修饰后，观察在限制性内切酶作用前后，DNA上修饰的纳米金在TEM表征下的不同来研究限制性内切酶的活性。同时在以上的实验中剪切位点有错配碱基T与T的时候，限制性内切酶不能作用，只有当在Hg2+条件下，形成T-Hg-T的稳定结构后，限制性内切酶才能发生作用。
　　第四章，通过溶血素纳米孔道研究凝血酶单分子的活性。通过用溶血素和卵磷脂的自由组装形成生物纳米孔道，利用溶血素孔径的特性来控制单链DNA和双链DNA通过孔径时不同的电流下降。研究了凝血酶与是凝血酶适体的亲和作用，当凝血酶作用下的ssDNA才能顺利的通过溶血素纳米孔道，同时也研究了颈环结构的解链时间与电压的关系。利用核酸适体实现单个酶分子的检测，对单个酶分子的实时生物化学反应和酶催化动力学进行研究，研究单个酶分子在许多非特异性结合位点中如何找到特异性位点，为解决生命科学中的重大问题提供理论依据。
　　第五章，结论部分，对全文内容进行了总结。

目录

摘要

第一章 绪论

1 纳米通道

1．1 自然态的通道

1．2 人工合成的通道

2 核酸内切酶

2．1 核酸内切酶简介

2．2 核酸内切酶的分类

2．3 限制性核酸内切酶作用

2．4 限制性内切酶的性质及应用

3 单分子检测(single molecules detection，SMD)

3．1 DNA简介

3．2 适体

3．3 单分子检测的分类

4 纳米粒子

4．1 纳米粒子简介

4．2 纳米金粒子

4．3 二氧化铈纳米粒子

5 凝胶电泳分析

5．1 电泳简介

6 膜片钳放大检测技术

6．1 膜片钳技术简介

6．2 电压钳位

6．3 单通道电流记录

7 立题依据和研究内容

第二章 基于溶血素纳米孔道检测Nb．BbvCI内切酶单分子

1 前言

2 实验部分

2．1 试剂与仪器

2．2 实验方法

3 结果与讨论

3．1 实验原理

3．2 实验过程

3．3 讨论P1、P2、P3穿过纳米孔道时的电流脉冲

4 小结

第三章 基于纳米金胶标记DNA的电化学检测

1 前言

2 实验部分

2．1 试剂与仪器

2．2 实验方法

3 结果与讨论

3．1 实验原理

3．2 利用凝胶电泳分离DNA

3．3 利用TEM表征反应前后的溶液

4 小结

第四章 基于溶血素纳米孔道检测凝血酶单分子

1 前言

2 实验部分

2．1 试剂与仪器

2．2 实验方法

2．3 实验原理

2．4 检测颈环结构S1穿过溶血素孔道的电流信号

2．5 检测凝血酶加入前后杂交颈环DNA穿过溶血素孔道的电流信号

2．6 讨论G1、G2、G3穿过纳米孔道时的电流脉冲

3 小结

第五章 结论

参考文献

致谢

附录：攻读硕士学位期间已发表和待发表的学术论文目录

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