基于工具酶信号放大技术化学发光成像分析法检测DNA单碱基错配及多组分小RNA

摘要

核酸是生命体最基本的表达物质之一，可以通过检测多种疾病表达的RNA以及基因突变对疾病进行治疗及预防。本文针对DNA单碱基错配和多组分小RNA检测两方面展开了以下两个方面的工作:
　　一、基于连接酶链式反应化学共振能量转移检测DNA单碱基错配的研究
　　基于连接酶链式反应(LCR)，建立了简单高效的DNA检测方法。将分别修饰生物素、荧光素、hemin适体和单一短链的四条探针DNA在单碱基错配DNA的作用下，通过Ampligase链接酶，引发LCR。采用链霉亲和素包被磁珠捕获产物，降低背景值。基于luminol-H2O2-DNA酶-荧光素化学共振能量转移体系，采用化学发光成像分析法实现对DNA单碱基错配的高灵敏检测。本方法选择性高，可识别单碱基突变型和野生型DNA。
　　二、基于循环放大技术化学发光成像分析法检测多组分小RNA的研究
　　基于茎环探针的剪切-复制技术，建立了一种高效分离及高灵敏检测多组分小RNA的方法。将茎环探针固定到磁珠表面，通过靶标小RNA打开相应的茎环探针，在Klenowexo-DNA聚合酶和Nb.BbvCI剪切酶的共同作用下，通过剪切-聚合-取代分子机器过程，将大量辣根过氧化物酶(HRP)修饰引物引入到磁珠表面，进而通过链取代反应，以luminol-H2O2为反应底物，对碘苯酚(PIP)为化学发光增强剂，采用化学发光成像分析法实现多靶标小RNA的同时检测。本方法灵敏度高、线性范围宽、特异性号、操作简单，为小RNA用于基因表达和分子诊断，特别是癌症早期诊断提供了一种新方法。

目录

摘要

第一章 绪论

1．化学发光

1．1 化学发光的产生机理

1．2 常用的化学发光反应体系

1．3 化学发光成像分析技术

1．4 化学发光的应用及进展

2 核酸

2．1 DNA简介

2．2 RNA简介

3 连接酶链式反应

3．1 概述

3．2 LCR产物的检测方法及发展

4 DNA分子机器的研究

4．1 DNA分子机器简介

4．2 DNA分子机器的分类

4．3 DNA分子机器的应用意义

5 课题意义及主要研究内容

第二章 基于连接酶链式反应化学共振能量转移检测DNA单碱基错配的研究

1 前言

2 实验部分

2．1 试剂与仪器

2．2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征

2．3 Luminol-H2O2-hemin-荧光素化学发光共振能量转移体系的条件优化

2．4 LCR检测DNA

2．5 选择性实验

2．6 混合样品分析

3 结果与讨论

3．1 实验原理

3．2 电泳表征

3．3 实验条件的优化

3．4 灵敏度实验

3．5 实验选择性的研究

4．小结

第三章 基于循环放大技术化学发光成像分析法检测多组分小RNA的研究

1 前言

2 实验部分

2．1 试剂与仪器

2．2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．3 小RNA多组分检测条件优化

2．4 多组分小RNA检测

2．5 选择性实验

3 结果与讨论

3．1 实验原理

3．2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征

3．3 小RNA检测实验条件优化

3．4 多组分小RNA检测

3．6 选择性

4 小结

结论

参考文献

致谢

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