莱茵衣藻硫酸盐通透蛋白反义RNA载体的构建及其对缺硫产氢的影响

摘要

随着世界范围内能源的紧缺，寻找可更新能源已显得越来越重要，氢气便是其中的一个重要的研究方向。近年来研究发现，莱茵衣藻在缺硫状态下产氢量会有较大的提高，但该方法会导致衣藻细胞受到极大伤害。目前主要的缺硫方法是两步法，即衣藻细胞在缺硫培养基中培养一段时间后在转接到正常培养基中进行复壮培养，如此循环。此方法不仅操作繁琐而且对衣藻细胞也有极大的伤害。在本研究中，我们构建了含有莱茵衣藻硫酸盐通透蛋白SulP2基因的反义RNA的载体，已期将该载体导入到衣藻细胞后，能引起衣藻运硫蛋白SulP2的基因沉默，从而在硫充足的衣藻培养基中便衣藻细胞达到与缺硫产氢相似的效果。
　　本论文主要内容及结果如下:
　　(1)构建含PstⅠ和XbaⅠ酶切位点和衣藻SulP2部分片段（约700bp）的载体pMD 18-T Vector，转化大肠杆菌感受态细胞。鉴定阳性的菌株进行测序，测序结果表明，载体构建正确。
　　(2)双酶切质粒pMD 18-T-SulP2和pChlamy_3 Veetor，分别纯化，然后用T4 DNA连接酶将SulP2基因反向连接到pChlamy_3 Vector质粒中，得到反义表达载体pCh-sulp2CDSR，转化大肠杆菌感受态细胞。鉴定阳性的菌株进行测序，测序结果表明，载体构建正确。
　　(3)将pCh-sulp2CDSR载体通过电击法转入莱茵衣藻细胞中，设计扩增潮霉素基因的特异性引物，PCR结果显示，扩增序列正确，说明载体pCh-Sulp2CDSR已经转入衣藻细胞中。
　　(4)测定了转基因衣藻（常衣藻培养基和限硫培养基）和野生型衣藻（正常培养基和缺硫培养基）中的生长动力学生长曲线。结果表明，相同培养条件下，转基因衣藻较野生型的生物量要少一些，但并不显著。
　　(5)通过QRT-PCR的方法检测了转基因衣藻中Rbcl、Rbcs、Ats(1)、Apr、Csase、Sir基因的表达情况。定量结果显示转基因衣藻中Rbcl、Rbcs基因的表达量有所下降;转基因衣藻中Ats(1)、Apr、Cys、Sir基因的表达水平明显上升。
　　(6)比较了野生型藻和转基因衣藻在TAP-S100、TAP-S70、TAP-S培养基中的产氢情况。结果表明，转基因衣藻较野生型衣藻的产氢量有明显的增加。

目录

摘要

主要符号说明

第一章 文献综述

1．1 生物制氢的研究进展

1．2 莱茵衣藻简介

1．3 莱茵衣藻产氢的研究进展

1．3．1 缺硫产氢

1．3．2 转基因衣藻产氢

1．3．3 衣藻突变体产氢

1．3．4 改造氢化酶

1．4 衣藻缺硫产氢的研究

1．4．1 衣藻缺硫产氢的机制

1．4．2 衣藻对缺硫环境的适应

1．5 硫酸盐通透酶

1．6 外源基因导入莱茵衣藻的方法

1．6．1 显微注射法

1．6．2 电击转化法

1．6．3 玻璃珠转化法

1．6．4 基因枪转化法

1．6．5 其他转化方法

1．7 衣藻转化的筛选标记

1．8 菜茵衣藻反义RNA技术

1．8．1 反义技术的定义

1．8．2 反义RNA的作用机制

1．8．3 反义RNA的构建

1．8．4 反义技术的意义与存在的问题

1．9 本实验研究的目的和意义

第二章 SulP2基因部分序列的克隆

2．1 材料与方法

2．1．1 藻种

2．1．2 菌株和基因片段

2．1．3 工具酶及试剂

2．1．4 仪器

2．1．5 主要试剂的配制方法

2．1．6 引物设计及合成

2．2 试验方法

2．2．1 莱茵衣藻的培养

2．2．2 莱茵衣藻总RNA提取与鉴定

2．2．3 总RNA反转录成cDNA

2．2．4 PCR扩增目的序列

2．2．5 DNA琼脂糖凝胶电泳检测

2．2．6 PCR产物回收

2．2．7 Sulp2片段DNA与T载体连接

2．2．8 制备感受态细胞

2．2．9 转化

2．2．10 氨苄青霉素抗性筛选

2．2．1 1 PCR鉴定pMD18-T-SulP2载体

2．2．12 大肠杆菌质粒提取

2．2．13 双酶切鉴定质粒pMD18-T-SulP2

2．2．14 测序鉴定

2．2．15 保存甘油种

2．3 结果与分析

2．3．1 提取莱茵衣藻总RNA

2．3．2 SulP2基因的PCR扩增结果

2．3．3 PCR和双酶切质粒pMD18-T-SulP2的鉴定结果

2．3．4 测序结果

2．4 本章小结

第三章 含Sulp2基因反义表达载体的构建及衣藻转化子的获得

3．1 材料与方法

3．1．1 质粒构建相关试剂

3．1．2 仪器

3．1．3 引物设计及合成

3．1．4 缓冲液的配制

3．2 试验方法

3．2．1 pCh-SulP2 CDSR载体的构建

3．2．2 转基因衣藻的获得

3．3 结果与分析

3．3．1 表达载体pCh-sulp2CDSR的构建图谱

3．3．2 PCR和双酶切质粒pCh-sulp2CDSR的鉴定结果

3．3．3 测序结果

3．3．4 衣藻转化子的获得

3．3．5 转基因衣藻的PCR扩增鉴定

3．4 本章小结

第四章 莱茵衣藻外源基因表达的研究

4．1 材料与方法

4．1．1 藻种

4．1．2 衣藻的培养基

4．1．3 试剂及仪器

4．1．4 定量引物设计

4．2 试验方法

4．2．1 衣藻细胞生长情况的测定

4．2．2 实时荧光定量检测转基因衣藻Rbcl、Rbcs、Ats1、Apr、Csase、Sir基因的表达情况

4．3 结果与分析

4．3．1 硫胁迫对衣藻生长的影响

4．3．2 实时荧光定量监测莱茵衣藻Rbcl、Rbcs、Ats1、Apr、Cys、Sir基因的表达情况

4．3．3 莱茵衣藻产氢量的测定

4．4 本章小结

结论与展望

参考文献

致谢

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