基于核酸工具酶辅助信号放大策略的高灵敏生物传感器构筑研究

摘要

本论文基于核酸工具酶和DNAzyme辅助的信号放大策略，成功构筑了三种新颖的、高灵敏的核酸传感检测平台，分别实现了核酸、蛋白及生物酶的高灵敏荧光分析检测。
　　第二章，基于外切酶Ⅲ辅助靶标自催化循环、DNAzyme信号放大策略，构建了一种高灵敏的荧光DNA生物传感器。本章设计的发夹结构的探针DNA，含有靶标DNA的识别片段和DNAzyme序列，但DNAzyme序列被隐藏在发夹内部而无活性。靶标DNA存在时，会与探针DNA杂交识别，诱导外切酶Ⅲ识别切割，释放出靶标DNA、二次靶标DNA片段，继续催化外切酶Ⅲ切割循环。同时，功能化的DNAzyme片段从探针结构中释放出来，在金属离子作用下切割荧光底物，产生荧光响应，通过检测荧光信号的变化实现对核酸的高灵敏分析。此传感器针对靶标DNA的检测下限可达20fM。
　　第三章，基于催化发夹状DNA组装编程的Mg2+-DNAzyme扩增策略，构建了一种针对蛋白质和核酸高灵敏荧光检测的新方法。针对蛋白质的分析检测，进一步结合终端保护策略，以亲和素作为分析物，与生物素标记的单链DNA亲和作用后，抑制外切酶Ⅰ对单链DNA的消解。进一步诱导发夹状DNA的催化组装，产生具有切割活性的DNAzyme结构，Mg2+作用下，切割底物，产生荧光信号，实现对亲和素的均相高灵敏分析检测。针对亲和素的检测限可达2pM。这种基于催化发夹状DNA组装编程的Mg2+-DNAzyme双信号放大检测策略，也被扩展应用于DNA的高灵敏分析检测，检测限达0.5pM，且具有很好的选择性。
　　第四章，基于等温链置换扩增技术，结合DNAzyme信号放大策略，实现了对DNA甲基化转移酶活性的高灵敏分析检测。设计发夹探针DNA和模板DNA，探针DNA上含有甲基化转移酶的识别位点。DNA甲基化后，可阻止限制性内切酶切割发夹DNA，在聚合酶和切刻内切酶的辅助下，聚合产生大量DNA片段。在模板DNA作用下，进一步通过链置换杂交反应扩增出大量具有切割酶活性的DNAzyme片段，实现DNA甲基化转移酶的高灵敏荧光分析检测，检测限可达1mU mL-1，为分析检测DNA甲基化转移酶提供了一种新的检测方法。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 生物传感器概述

1．2 DNA生物传感器概述

1．3 DNA生物传感器的应用

1．3．1 DNA生物传感器检测金属离子

1．3．2 DNA生物传感器检测核酸

1．3．3 DNA生物传感器检测生物分子

1．3．4 DNA生物传感器检测生物酶

1．4 DNA生物传感器信号放大策略概述

1．4．1 无酶辅助的信号放大策略

1．4．2 基于核酸工具酶辅助的信号放大策略

1．4．3 后续信号转换放大策略

1．5 DNA生物传感器检测方法概述

1．5．1 电化学DNA生物传感器

1．5．2 比色DNA生物传感器

1．5．3 荧光DNA生物传感器

1．5．4 基于其他检测方法的DNA生物传感器

1．6 基于金属离子DNAzyme的荧光DNA生物传感器

1．6．1 基于Zn2+-DNAzyme的荧光DNA生物传感器

1．6．2 基于Pb2+-DNAzyme的荧光DNA生物传感器

1．6．3 基于Mg2+-DNAzyme的荧光DNA生物传感器

1．7 课题依据及主要内容

第二章 基于外切酶Ⅲ辅助级联放大策略构筑高灵敏的荧光生物传感器检测DNA

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂与仪器

2．2．2 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 实验原理

2．3．2 外切酶Ⅲ辅助的生物传感器可行性分析

2．3．3 外切酶Ⅲ辅助的生物传感器条件优化

2．3．4 外切酶Ⅲ辅助的生物传感器灵敏度分析

2．3．5 外切酶Ⅲ辅助的生物传感器的选择性分析

2．4 本章小结

第三章 基于链置换反应辅助信号放大策略检测蛋白和核酸

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂与仪器

3．2．2 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 实验原理

3．3．2 DNA生物传感器的可行性分析

3．3．3 DNA生物传感器的条件优化

3．3．4 DNA生物传感器的灵敏度分析

3．3．5 DNA生物传感器的选择性分析

3．4 本章小节

第四章 基于等温链置换扩增技术辅助信号放大策略构筑超灵敏的生物传感器检测甲基化转移酶

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂与仪器

4．2．2 实验部分

4．3 结果与讨论

4．3．1 实验原理

4．3．2 检测酶的荧光生物传感器的可行性分析

4．3．3 检测酶的荧光生物传感器的条件优化

4．3．4 检测酶的荧光生物传感器的灵敏度分析

4．3．5 检测酶的荧光生物传感器的选择性分析

4．4 本章小结

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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