葡萄糖氧化酶作为标记物的光致电化学分析法研究

摘要

免疫分析法是利用抗原和抗体特异性反应来检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。由于抗原与抗体的特异性结合无法给出明显的物理信号，所以免疫分析法大多采用标记技术，其中酶联免疫分析法的应用最为广泛。然而，在电化学酶联免疫分析法中，酶的氧化还原媒介具有成本高、潜在的细胞毒性和低选择性等缺点，常用的底物过氧化氢也由于其氧化还原电位较高而降低检测的选择性。本文基于葡萄糖氧化酶（GOD）的直接电子传递，不使用传统意义上的电子媒介，再结合光致电化学（PEC）检测技术，发展了一种以葡萄糖氧化酶作为标记物的光致电化学免疫分析法。 首先将光敏材料ZnO电沉积到ITO电极上，形成纳米ZnO光电极；再将包被抗体组装到光电极表面构成免疫探针，通过抗原和葡萄糖氧化酶标记二抗的夹心方式完成免疫反应，最后利用壳聚糖实现纳米ZnO光电极在光照下与葡萄糖氧化酶的辅酶－黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的直接电子转移，从给出的光电流完成样品的检测。与传统型的电化学酶联免疫分析法相比，具有选择性好，灵敏度高和检测范围宽等优点。 研究工作主要分为以下三个部分： 1.将光敏材料ZnO电沉积到ITO电极上，形成纳米ZnO光电极。分别通过对FAD进行化学还原（使用 Na2SO3）和电化学还原（使用第二工作电极）得到还原产物FADH2，发现其能与光照下的纳米 ZnO 光电极发生 PEC 反应，产生光电流；且光电流与FAD在一定浓度下有较好的线性关系。选用壳聚糖作为电子导线，GOD（FAD）与光电极的直接电子转移得到验证，为将GOD作为标记物的PEC免疫分析法奠定了理论基础。 2. 事先将 GOD 与检测抗体（二抗）固定在金纳米粒子上作为酶标抗体；然后固定多壁碳纳米管(MWCNTs)在纳米ZnO光电极表面上；再利用MWCNTs丰富的羧基作为结合位点，将CEA（癌胚抗原）单克隆抗体包被在光电极表面以完成免疫探针的构建。在完成双抗体夹心法的免疫反应后，用底物葡萄糖还原GOD（FAD）所产生的FADH2作为电子供体，经壳聚糖传递电子给光照下的纳米 ZnO 光电极，以获得的光电流定量CEA。文中，通过交流阻抗（EIS）、扫描电镜、紫外和透射电镜分别对免疫探针、酶标抗体和免疫反应状态进行了表征，优化了偏压、电解液pH、免疫反应的孵化时间和温度对光电流响应的影响。结果显示，随着CEA浓度的增加，光电流响应呈指数增加，光电流强度与 CEA 浓度的对数成正比，相关系数 R2为0.9982，检测范围为0.001-100 ng/mL，检测限为0.3 pg/mL。通过比较使用和不使用电子导线（壳聚糖）的PEC 免疫传感器，发现利用直接电子转移的PEC 免疫分析法的检测灵敏度较高、检测范围更宽。 3.改变抗原抗体对，用CA199抗原作为样品，按同样的方法构建了另一种PEC免疫传感器。在优化了传感器的制备和测量条件后，光电流强度与CA199浓度的对数成正比，相关系数R2为0.9987，检测范围为0.001-100 ng/mL，检测限为0.3 pg/mL。分别试验了壳聚糖或离子溶液作为两种不同电子导线对CA199的检测效果，发现使用壳聚糖作为电子导线时，PEC免疫传感器具有更好的性能。

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