功能金纳米材料的制备及对细胞内活性物质的成像检测和靶向药物传递中的应用

摘要

金纳米颗粒具有独特的表面等离子体共振（LSPR），在光谱应用中表现出了优异的特性，近年来受到人们的广泛关注。尤其是以牛血清白蛋白（BSA）为保护剂合成的金纳米团簇，具有尺寸小、可以产生特定的能级分离、并在一定波长的光激发下发射出荧光等特性；金纳米棒能够产生两个不同的等离子体共振吸收，且表面等离子体共振波长可随金纳米棒的长宽比变化，从可见（550 nm）到近红外（1550 nm）连续可调。因此，金纳米团簇和金纳米棒以其独特的物理和化学性质引起了人们的广泛关注，在生物标记、光学成像、靶向药物治疗等领域得到了广泛的应用。 1、以BSA为保护剂合成的金纳米簇（BSA@AuNCs）在紫外光的照射下能够发出红色的荧光（发射峰可达到650 nm）。由于Cu2+能够与BSA中的氨基酸进行螯合，因此，加入Cu2+能够将BSA@AuNCs的荧光猝灭。而焦磷酸盐（PPi）与Cu2+的结合力远大于Cu2+与BSA中氨基酸的结合力，因此当体系中有PPi存在时，PPi能够将Cu2+从BSA@AuNCs中置换出来，将BSA@AuNCs的荧光恢复。在一定浓度范围内，荧光恢复强度与PPi的浓度成正比关系。作为端粒酶扩增反应的副产物，在端粒生长过程中，PPi浓度与端粒酶活性相关，因此可以通过PPi使Cu2+-BSA@AuNCs探针的荧光恢复强度实现端粒酶活性的检测。该检测方法具有高的灵敏度和较宽的检测范围（10 nU/mL到10 fU/mL），并且可以通过细胞成像检测宫颈癌细胞中端粒酶的活性。 2、在癌症治疗方法的发展中，目前研究的热点是以成像技术为基础的关于如何高效地将药物运输到靶标位置的研究。本工作以BSA@AuNCs为靶向药物运输骨架，修饰上能够特异性识别肿瘤细胞的RGD短肽，以提高细胞内吞的效率。将癌症治疗药物阿霉素（DOX）通过二硫键的连接装载到BSA@AuNCs中，组成靶向药物输送体系—DOX/RGD-BSA@AuNCs。通过高分辨透射电镜和共聚焦激光荧光显微镜对BSA@AuNCs的物理性质和生物学特性进行了表征。在RGD的作用下，DOX/RGD-BSA@AuNCs成功进入肿瘤细胞。肿瘤细胞中过度表达的谷胱甘肽（GSH）剪切二硫键，DOX从药物输送体系中被释放出来进入细胞核，发挥药效，抑制肿瘤细胞的生长。本章中制备的DOX/RGD-BSA@AuNCs载药体系不仅可以用于药物运输，还可通过成像技术检测药物达到抑制肿瘤细胞生长的过程，在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。 3、肿瘤细胞成像与治疗的结合对于生物医学研究和临床实践至关重要。因此，本章设计了一种多功能金纳米探针—DOX/RGD-DNA@AuNRs 用于microRNA（miRNA）引发的细胞成像和靶向药物治疗的监测。多功能金纳米探针是由金纳米棒通过引入RGD作为靶标识别元件，修饰羧基荧光素（FAM）的DNA自组装结构作为信号开关组装而成的。DOX能够通过物理作用嵌插到DNA中，从而固定到金纳米棒上（AuNRs）。通过RGD对肿瘤细胞的靶向识别作用，将DOX/RGD-DNA@AuNRs导入癌细胞，同时，在细胞内的miRNA的作用下，DNA自组装结构破坏，使FAM的荧光激活，同时释放DOX。这项工作提供了一个简单且作用强大的多功能金纳米探针，在癌症成像、治疗和治疗监测方面具有巨大的潜力。

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第一章 文献综述

1.1金属纳米材料

1.1.1金属纳米材料概述

1.1.2金属纳米材料的性质

1.1.3不同形状金属纳米材料的制备

1.1.4金属纳米材料的应用

1.2金属纳米团簇

1.2.1金属纳米簇概述

1.2.2金属纳米团簇的制备

1.2.3金纳米团簇的性质

1.2.4金纳米团簇的应用

1.3金纳米棒

1.3.1金纳米棒的概述

1.3.2金纳米棒制备

1.3.3金纳米棒的性质

1.3.4金纳米棒表面修饰和功能化

1.3.5金纳米棒的应用

第二章 基于BSA保护的金纳米簇作为荧光探针对肿瘤细胞端粒酶活性的检测

2.1引言

2.2实验部分

2.2.1试剂与仪器

2.2.2 实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1金纳米簇的荧光纳米探针灵敏的检测端粒酶的实验原理

2.3.2 BSA@AuNCs的性质表征

2.3.3 BSA@AuNCs的稳定性

2.3.4 BSA@AuNCs作为纳米探针对端粒酶检测的可行性

2.3.5 Cu2+对BSA@AuNCs溶液的猝灭

2.3.6 PPi对BSA@AuNCs-Cu2+溶液的荧光恢复

2.3.7 反应体系条件的优化

2.3.8商品化端粒酶的检测

2.3.9 细胞提取端粒酶的检测

2.3.10端粒酶成像检测

2.4小结

第三章 基于BSA@AuNCs纳米结构的构建对细胞成像及靶向药物运输

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1试剂与仪器

3.2.2 实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1 BSA@AuNCs纳米结构的构建对细胞成像及靶向药物运输实验原理

3.3.2 BSA@AuNCs和DOX/RGD-BSA@AuNCs的表征

3.3.3 BSA@AuNCs，RGD-BSA@AuNCs和DOX/RGD-BSA@AuNCs的粒度

3.3.4细胞内成像及药物释放的可行性

3.3.5细胞内成像及药物释放的实时成像实验

3.3.6 DOX/RGD-BSA@AuNCs在多种肿瘤细胞中的成像

3.3.7 GSH的剪切作用

3.3.8细胞凋亡的流式细胞术分析

3.3.9体内抗肿瘤作用实验

3.3.10体内毒性检测及治疗

3.3.11 DOX/RGD-BSA@AuNCs的选择性实验

3.4小结

第四章 基于功能化金纳米棒为荧光纳米探针对microRNAs引发的细胞成像和靶向药物传递

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1试剂与仪器

4.2.2 实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1基于金纳米棒和DNA为载体实现靶向药物传递和生物成像的实验原理

4.3.2金纳米棒表征

4.3.3 DNA1@AuNRs制备的表征

4.3.4 DNA自组装结构的表征

4.3.5 DOX/RGD-DNA@AuNRs制备的表征

4.3.6 MiRNA-21检测实验条件的优化

4.3.7 MiRNA-21的体外检测

为了评估DOX/RGD-DNA@AuNRs检测miRNA-21的灵敏度，在优化后的最佳实验条件下，对

4.3.8 细胞成像实时检测

4.3.9 MiRNA-21的细胞成像

4.3.10细胞凋亡检测

4.3.11 特异性检测

4.4小结

结 论

参考文献

致 谢

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