EB病毒相关胃癌组织中EB病毒基因亚型的检测与分析

摘要

目的：明确EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)相关胃癌(EBV-associated gastric carcinoma，EBVaGC)组织中EBV 1和2型变异、F和f变异以及I和i变异的分布及LMP1基因的多态性，探讨EBV基因变异与EBVaGC的相关性。 方法：应用PCR-Southern技术检测185例胃癌组织EBVDNA，对阳性标本进一步用原位杂交法检测EBV编码的小RNA1(EBER1)，证实EBV感染的存在，比较EBVaGC和EBV阴性胃癌(EBV-negative gastric carcinoma，EBVnGC)临床指标的差异。应用PCR结合限制性片段多念性技术检测12例山东地区EBVaGC组织中EBV1和2型变异、F和f变异以及I和i变异情况。应用PCR测序检测12例山东地区EBVaGC和8例日本EBVaGC组织中LMP1C术端序列，比较中国和同本分离株的序列的异同，绘制系统进化树。 结果：①185例胃癌组织中有13例为EBVaGC，EBV阳性率为7.03％；而癌旁组织均为阴性，两种组织中EBV阳性率有显著性差异(X2=11.0769，P=0.0009)。统计学分析表明EBVaGC和EBVnGC在年龄、病理类型、临床分期、淋巴结转移和发病部位的差异均无显著性，P值分别为0.669，0.14l，0.259，0.818，0.064，但性别之间的差异有显著性，男性EBV阳性率高于女性(X2=3.9404，P=0.0471)。②12例标本EBV分离株均为1型和F变异，11例为i变异，1例为I变异。③10例中国EBVaGC(83.3％)和8例(100％)同本EBVaGC LMP1亚型为China 1，2例中国分离株为B95-8亚型。18例China 1亚型分离株除特征性变异外还有其它变异，所有日本分离株(100％)及5例中国分离株(50％)具有2个或2个以上其它变异，前者变异率高于后者，差异有显著性(P=0.0359)。 结论：①EBV感染与胃癌的发生发展有一定相关性，EBVaGC好发于男性，但EBV感染与胃癌病人年龄、病理类型、临床分期、淋巴结转移和发病部位无明显相关性。②EBVaGC中EBV以I型，i及F变异较多见。③山东地区和同本EBVaGC中LMP1亚型以China 1亚型为主，与中国南方鼻咽癌中LMP1亚型的分布相似，同本分离株比中国分离株具有更多的China 1亚型特征性变异以外的其它变异，支持China 1亚型是代表地理位置相关的基因多态性而不是与鼻咽癌相关的基因多态性。

目录

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声明

引言

第一章材料与方法

1.1仪器、试剂和耗材

1.1.1主要仪器

1.1.2主要试剂和耗材

1.2研究对象

1.3核酸提取

1.3.1单细胞悬液的制备

1.3.2组织细胞DNA提取

1.4 PCR-Southern杂交检测EBV基因组

1.4.1 EBV BamH Ⅰ-W片段扩增

1.4.2寡核苷酸探针标记

1.4.3 PCR产物转膜

1.4.4 Southern blotting

1.5原位杂交检测EBV EBER1的表达

1.6 EBVaGC标本1型和2型变异、F和f变异以及Ⅰ和i变异的检测

1.6.1引物的选择

1.6.2 PCR检测

1.6.3 PCR产物的限制性酶切分析

1.6.4 PCR产物测序

1.7 EBVaGC LMP1 C末端序列变异的检测

1.7.1 PCR扩增

1.7.2 DNA序列检测

1.7.3系统进化树分析

1.8实验结果的统计学分析

第二章结果

2.1胃癌组织和相应癌旁组织中EBV基因组及EBER1的检测

2.2 EBV感染与病人临床病理特征的关系

2.3 EBVaGC组织中病毒基因多态性检测结果

2.3.1F和f变异的检测结果

2.3.2 Ⅰ和i变异的检测结果

2.3.3 1型和2型变异的检测结果

2.4中国和日本EBV相关胃癌组织中LMP1的变异

2.4.1中国及日本EBVaGC组织中LMP1基因的共同变异

2.4.2 LMP1 33bp重复序列的变异

2.4.3 GC分离毒株的其它突变及缺失

2.4.4系统进化树分析

第三章讨论

3.1 EBV感染与胃癌的关系

3.2 EBVaGC中1和2型、F和f变异及Ⅰ和i变异的分布

3.3 EBVaGC中LMP1基因的多态性

第四章结论

参考文献

综述EB病毒非多聚腺苷酸化小RNA（EBERs）的研究现状

攻读学位期间的研究成果

致谢