热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定

摘要

目的：构建人热休克蛋70(heat shock protein70，HSP70)的腺病毒表达载体，旨在将成功构建的携带外源基因HSP70的重组腺病毒感染靶细胞，从而为进一步探讨HSP70对应激状态下细胞的保护作用奠定了实验基础。 方法：自热休克处理后的人宫颈癌细胞系Hela中提取细胞总RNA，经逆转录反应后，利用人工合成的引物行PCR扩增，获得目的基因HSP70的cDNA。将外源cDNA定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上，采用AdEasy系统在原核细胞：E.coliBJ5183中完成穿梭质粒pAdTrack-CMV-HSP70与骨架质粒pAdEasy-1之间的高效f刊源重组，构建HSP70重组腺病毒载体。重组体经筛选后，脂质体法转染人胚肾293细胞，包装产生重组腺病毒vAd-HSP70。最后，收获病毒进行滴度鉴定，用RT-PCR方法检测目的基因在人宫颈癌Hela细胞的转录表达。 结果：通过PCR、序列测定以及限制性酶切证实HSP70基因能够正确插入腺病毒表达载体，并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒；荧光显微镜卜可观察到GFP的表达，收获病毒的滴度为3.2×1012IU/L，获得了病毒滴度较高的重组腺病毒。 结论本研究成功的构建了pAd-HSP70重组腺病毒表达载体，并在人胚肾293细胞中包装获得重组腺病毒vAd-HSP70，且证明了重组腺病毒vAd-HtSP70可在人宫颈癌系Hela细胞内稳定表达目的基因并有效转录。

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引言

第一章实验材料

1.1主要仪器

1.2主要试剂与耗材

1.3重用试剂的配置方法

第二章实验方法

2.1目的基因的制备

2.1.1宫颈癌细胞Hela细胞总RNA的提取

2.1.2引物的设计与合成

2.1.3 RT-PCR扩增HSP70cDNA

2.1.4 RT-PCR扩增产物的纯化

2.1.5目的基因的序列测定

2.2重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HSP70的构建

2.2.1目的基凶及载体pAdTrack-CMV双酶切和回收

2.2.2目的基因与载体的连接

2.2.3重组质粒的转化

2.2.4重组质粒的提取

2.2.5重组骨架质粒的鉴定

2.3 RecA+BJ5183宿主菌中构建重组子

2.3.1重组质粒的线性化和去磷酸化

2.3.2穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的共转化

2.3.3重组子的保存和大量制备

2.3.4重组质粒pAd-HSP70序列测定

2.4重组腺病毒载体pAd-HSP70转染HEK293包装细胞

2.5重组腺病毒vAd-HSP70滴度的测定

2.6重组腺病毒目的基因表达的检测

第三章实验结果

3.1 RT-PCR检测目的基因的转录表达

3.2目的基因的序列测定

3.3重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HSP70的鉴定

3.4大肠杆菌RecA+BJ5183中重组腺病毒载体pAd-HSP70的构建

3.5重组腺病毒的包装和病毒滴度测定

3.6 RT-PCR鉴定外源基因的转录

第四章讨论

结论

参考文献

综述 热休克蛋白70对应激条件下细胞的保护作用研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢