高糖环境对角膜上皮修复和角膜缘干细胞活性影响的实验研究

摘要

目的:
　　 利用角膜缘干细胞体外模型和Ins2Akita糖尿病小鼠模型,研究高糖环境对角膜缘上皮干细胞活性以及角膜上皮修复的影响。
　　 方法:
　　 1.采用小鼠角膜缘上皮干/祖细胞系(TKE2)作为体外细胞模型,在培养基中添加终浓度为30mM的葡萄糖进行处理,模拟糖尿病角膜病变的高糖微环境,通过相差显微镜观察、MTT、干细胞克隆形成、AnnexinV-PI和8-OHdG(DNA单链断裂标记)免疫染色等实验,观察高糖环境对角膜上皮干细胞形态变化、克隆形成能力、细胞增殖、凋亡、DNA稳定性等方面的影响。
　　 2.选择同龄成年雄性C57BL/6小鼠(正常对照组)和Ins2Akita小鼠(糖尿病组)各10只,比较2组小鼠在体重、血糖水平的差异;刮除小鼠角膜中央2mm的上皮,观察并比较角膜上皮在损伤后0h、24h、48h、64h、76h、88h、100h、136、172h的修复情况,并通过透射电镜、HE..染色、TUNEL(凋亡)标记染色、8-OHdG对角膜上皮的形态改变、细胞凋亡及DNA稳定性进行检测分析。
　　 结果:
　　 1.体外细胞模型的结果显示,高糖处理后的TKE2细胞呈长梭形,随着高糖处理时间的延长,细胞状态变差;高糖组干细胞克隆直径较小,克隆形成率明显降低(正常组为28.333±5.508,高糖处理3代TKE2克隆形成率为6.333±1.155),比较有统计学意义(P＜0.05);MTT检测发现,正常组和高糖处理1代细胞间增殖能力有差异(P72h=0.013),高糖处理3代后差异更为明显(P72h=0.000);细胞凋亡检测示正常组早期凋亡细胞比例为8.02±3.14,高糖组早期凋亡细胞比例为33.13±2.63,差异有统计学意义(P＜0.001);高糖处理3代后的细胞8-OHdG阳性染色较正常细胞明显增强。
　　 2.Ins2Akita糖尿病小鼠在8周的检测周期内,其体重增加与正常小鼠相比明显减少,血糖维持在相对稳定的高水平;糖尿病组小鼠的角膜上皮愈合时间为刮除后172h,愈合速度较正常对照组(48h)明显延迟,并且在88h出现缺损面积的扩大;电镜观察显示,糖尿病小鼠角膜上皮细胞表面微绒毛和微皱褶明显减少,角膜基底层上皮细胞排列尚规则,但细胞体积增大,基底细胞空泡化明显,细胞间桥粒连接较少,角膜上皮与基底膜间的半桥粒明显减少;HE..染色示糖尿病小鼠角膜上皮细胞表面不平整,形态不规则,细胞间连接疏松,细胞层数减少,分界不清,角膜上皮层基底细胞空泡形成,基质层明显水肿;TUNEL结果示角膜上皮基底层细胞TUNEL标记染色较正常组明显增多;8-OHdG的染色结果示角膜上皮基底层细胞8-OHdG标记染色阳性细胞较正常对照组明显增多。
　　 结论:
　　 1.体外高糖处理条件下,角膜上皮干细胞的形态发生改变,角膜上皮干细胞的克隆形成能力和增殖明显受到抑制;早期凋亡细胞明显增多;基因组稳定性下降。
　　 2.Ins2Akita糖尿病小鼠角膜上皮修复速度明显减慢,并出现反复剥脱现象;角膜基底层的上皮细胞形态变化明显、角膜上皮基底层细胞的凋亡增加及其DNA稳定性下降。