7-脱氢胆固醇还原酶基因在小鼠胚胎腭突发育中的作用

摘要

目的:
　　 研究7-脱氢胆固醇还原酶基因(Dhcr7)在小鼠胚胎腭突发育中的表达及表达量变化，Dhcr7表达下调对腭突发育融合的影响，及Dhcr7在腭突发育中参与的音猬因子(Shh)信号通路的研究。
　　 方法:
　　 1:取E13.5、E14.5和E15.5天的小鼠胚胎的腭突，免疫组织化学观察Dhcr7蛋白在腭突中的表达定位，逆转录式聚合酶链式反应法检测Dhcr7 mRNA的表达变化，Western blot法检测Dhcr7蛋白的表达变化。
　　 2:构建抑制Dhcr7基因表达的siRNA重组腺病毒载体。取E13.5天的腭突进行体外培养，随机分为正常对照组、阴性对照腺病毒组和siDhcr7-腺病毒组，培养48h后分别固定和提取总RNA、总蛋白，进行组织染色、扫描电镜和RT-PCR、WB分析，siDhcr7-腺病毒组于48h后更换培养基随机分为四组分别添加Ong/ml、200ng/ml、400ng/ml和600ng/ml浓度的胆固醇，继续培养72h后固定，SEM和组织染色观察融合情况。
　　 3:取E13.5天腭突进行培养，分为空白对照组、siDhcr7-腺病毒组和Dhcr7抑制后加胆固醇组，前两组于培养48后更换不含胆固醇培养基，最后一组更换含有600ng/ml胆固醇培养，继续培养72h;分别进行固定，行组织染色和SEM观察形态变化;分别提取总RNA和总蛋白质应用RT-PCR和WB检测Dhcr7、Shh和Bmp2表达量的变化。
　　 结果:
　　 1.Dhcr7主要表达在EPM细胞，E15.5的Dhcr7mRNA表达量与E13.5和E14.5相比分别减少了30.3％和22.6％，差异有统计学意义(P＜0.05)，E13.5于E14.5相比差异没有统计学意义(P＞0.05)' E15.5的蛋白表达量与E13.5和E14.5相比分别减少了55.6％和53.9％，差异有统计学意义(P＜0.05)，E13.5于E14.5相比差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　 2.正常对照组和阴性腺病毒对照组在48h时两侧腭突融合，形成连续的上腭，而siDhcr7-腺病毒组几乎没有生长，两侧腭突之间有很宽的裂隙;siDhcr7-腺病毒组Dhcr7的mRNA和蛋白表达量与正常对照组和阴性对照组相比分别减少了60.8％和62.5％，差别有统计学意义(P＜0.05);添加梯度胆固醇后，只有600ng/ml组融合，其余组均没融合。
　　 3.空白对照组和添加胆固醇组腭突能完全融合，而siDhcr7-腺病毒组没融合。Shh和Bmp2在siDhcr7-腺病毒组的mRNA和蛋白质的表达量都随着Dhcr7表达量降低而降低;添加胆固醇后，Dhcr7的mRNA和蛋白质的表达量基本没有变化，与siDhcr7-腺病毒组相比差别没有统计学意义(P＞0.05)，但是Shh和Bmp2表达量明显升高，与siDhcr7-腺病毒组相比差别有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 Dhcr7在腭突发育中的关键阶段有表达，并且表达量与其生长发育有密切关系;Dhcr7在腭突中的表达下调后，腭突融合失败，而添加一定量的胆固醇能逆转其抑制作用;并且Dhcr7通过参与Shh-Bmp信号通路而调节腭突的发育。

目录

摘要

引言

第一部分 Dhcr7在小鼠胚胎腭突发育中的表达及表达量变化

1、目的

2、材料和方法

3、结果

4、讨论

第二部分 腺病毒载体介导的RNA干扰抑制体外培养腭突Dhcr7表达的研究

1、目的

2、材料和方法

3、结果

4、讨论

第三部分 体外腭突培养Dhcr7沉默对Shh信号通路影响的研究

1、目的

2、材料和方法

3、结果

4、讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

附录

致谢

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