耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表型与基因型分析研究

摘要

目的:通过分析临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株(methicillin-resistantstaphylococcus aureus，MRSA)对多种抗菌药物的耐药性及耐药特点，从表型和基因型两个层面来分析研究MRSA的多重耐药机制，寻找药物作用的新靶点，为临床合理有效使用抗菌药物，治疗MRSA感染以及预防耐药菌株的不断扩大提供一定的帮助。
　　方法:
　　(1)本实验收集了山西医科大学第一医院检验科、山西医科大学第二医院检验科和山西省人民医院检验科从2012年1月到12月分离的金黄色葡萄球菌152株。采用法国梅里埃VITEK-Ⅱ细菌鉴定系统对收集菌株进行了确证试验，152株均为金黄色葡萄球菌。依据美国临床实验室标准化研究所(NCLSI)标准操作规程，采用K-B（Kirby-Bauer）琼脂扩散法和法国梅里埃VITEK-Ⅱ药敏分析系统对收集菌株进行了耐药表型确证和药物敏感试验，其中51株为MRSA，并对51株MRSA进行了β-内酰胺酶检测和耐药特点分析。
　　(2)用E-test卡测定了实验菌株对万古霉素的敏感性，即实验菌株对万古霉素的最低抑菌浓度(MIC)。
　　(3)提取51株MRSA菌株DNA，采用特异性引物序列聚合酶链式反应(PCR)扩增法进行mecA、mecI、mecR1基因检测。
　　(4)挑选4株具有代表性和特殊性的菌株，对其DNA扩增产物进行测序。
　　(5)运用多重PCR扩增法对其进行了MRSA的耐药性基因岛(SCCmec)分型。
　　(6)同时运用多重PCR扩增法进行MRSA毒力基因方面的研究。
　　结果:
　　(1) MRSA对β-内酰胺类药物高度耐药，耐药率达100％，环丙沙星、左氧氟沙星、克林霉素、红霉素、四环素、替考拉宁、复方磺胺甲恶唑、磷霉素、利奈唑胺、利福平和万古霉素的耐药率分别为88.2％、86.3％、86.3％、84.3％、82.4％、0％、15.7％、29.4％、0％、39.2％、0％。
　　(2)未发现耐万古霉素的菌株。
　　(3)实验菌株mecA、mecI、mecR1基因检出率全部为100％。
　　(4)基因测序表明本地MRSA菌株与基因库中已报道的菌株同源性在97％以上。
　　(5)实验菌株SCCmec分型发现多为Ⅱ型和Ⅲ型，另有29株可能为Ⅱ型新的亚型。
　　(6)毒力基因检测显示femA基因检出率为100％，肠毒素基因see携带率为76.5％，sed携带率为47.1％，sec携带率为5.9％;表皮剥落素基因etb携带率为49.0％;中毒性休克综合症毒素基因tst携带率为5.9％;有43.1％(22/51)株菌株同时带有两种肠毒素基因，有39.2％(20/51)株菌株同时带有两种毒素基因，有5.9％(3/51)株菌株同时带有三种毒素基因。
　　结论:
　　(1)收集的金黄色葡萄球菌中，β-内酰胺类药物耐药率高达100％，MRSA对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺敏感，对其他抗菌药物均呈多重耐药，耐药趋势严峻，需要对目前药效的抗生素规范管理以延缓其耐药进程。加强对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺等常用药物最小抑菌浓度(MIC)的监测和临床报告，关注万古霉素对MRSA治疗效果不佳的患者。
　　(2)通过基因扩增和测序发现本地区菌株的mec基因主要是A型，菌株的同源性与已报道的菌株同源性在97％以上，同源性比较高，未出现较大的变异株。
　　(3)运用多重PCR技术对51株MRSA进行SCCmec分型，发现了Ⅱ型新的亚型。探明了本地区MRSA的SCCmec型别或者亚型种类，阐明了本地区MRSA多重耐药现状及流行趋势，为临床制定有效的预防策略和治疗措施、控制MRSA的漫延以及暴发流行提供了科学依据，为更加深入了解和研究MRSA多重耐药特征及其耐药机制奠定了基础。
　　(4)毒力基因检测发现，本地区MRSA不仅高度耐药，SCCmec亚型同时耐两类四种抗菌药物，同一菌株同时可检测到两种毒素基因，表明耐药程度严重，多重耐药模式复杂。