白细胞介素17在铜绿假单胞菌性角膜炎中对MerTK阳性细胞的调控作用

摘要

目的：研究白细胞介素17（Interleukin-17，IL-17）在易感型C57BL/6小鼠和抵抗型BALB/c小鼠铜绿假单胞菌性角膜炎中的表达，IL-17在C57BL/6小鼠以及BALB/c小鼠铜绿假单胞菌性角膜炎中的功能，以及对MerTK阳性细胞、巨噬细胞和MerTK阳性巨噬细胞的调控作用。
　　方法：1、易感型C57BL/6小鼠和抵抗型BALB/c小鼠，建立小鼠铜绿假单胞菌性角膜炎动物模型，观察感染后两种小鼠角膜感染的临床评分，采用PCR法和ELISA法检测两种小鼠正常角膜和铜绿假单胞菌感染后1天、5天角膜中IL-17 mRNA的表达以及正常角膜和感染后1天、3天和5天IL-17蛋白的表达；利用免疫荧光双染法检测中性粒细胞和巨噬细胞是否是感染后角膜中IL-17的主要细胞来源。2、给予BALB/c小鼠重组IL-17蛋白预处理，建立小鼠角膜炎动物模型，观察预处理前后正常角膜和感染后1天和5天小鼠角膜中炎症细胞因子MIP-2、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、ICAM-1以及抗炎细胞因子IL-10的mRNA的表达；利用ELISA检测正常角膜和感染后3天、5天MIP-2、 IL-1β、TNF-α蛋白的表达；MPO法检测感染后3天、5天角膜中性粒细胞浸润数。给予BALB/c小鼠IL-17中和抗体预处理，建立角膜铜绿假单胞菌感染模型，观察临床评分，利用PCR、ELISA及MPO检测预处理前后角膜中促炎细胞因子和抗炎细胞因子表达以及中性粒细胞浸润的改变。给予C57BL/6小鼠IL-17中和抗体，观察临床评分，利用ELISA检测预处理前后感染3天、5天角膜中MIP-2、IL-1β、TNF-α蛋白的表达，MPO检测角膜中性粒细胞浸润的改变。3、检测易感型C57BL/6小鼠和抵抗型BALB/c小鼠铜绿假单胞菌性角膜炎感染后角膜中Caspase3、Caspase8、Caspase9、Bcl-2、Fas和FasL基因和蛋白的表达，利用免疫荧光染色检测两种小鼠角膜感染后MerTK阳性巨噬细胞的比例，并进行细胞计数和分类检测MerTK阳性细胞和巨噬细胞数。分别给予C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠IL-17中和抗体，利用免疫染色法及流式细胞计数法检测给予IL-17中和抗体对C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠感染后角膜中MerTK阳性细胞、巨噬细胞数和MerTK阳性巨噬细胞比例的影响。给予BALB/c小鼠IL-10中和抗体，采用流式细胞计数检测中和IL-10对BALB/c小鼠角膜MerTK阳性细胞和巨噬细胞的影响。
　　结果：1、C57BL/6小鼠角膜铜绿假单胞菌感染5天IL-17mRNA和感染后1天、3天、5天IL-17蛋白的表达高于BALB/c小鼠角膜中的表达，正常小鼠角膜中无IL-17表达。C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠感染后角膜中浸润的细胞主要是中性粒细胞和单个核细胞，中性粒细胞和巨噬细胞是两种小鼠角膜铜绿假单胞菌性角膜炎IL-17的细胞来源。2、重组IL-17蛋白预处理BALB/c小鼠可以降低炎症细胞因子MIP-2、IL-1β、TNF-α、IL-6、ICAM-1和抗炎细胞因子IL-10 mRNA的表达，MIP-2蛋白水平下降，但TNF-α、IL-1β蛋白水平无明显改变，临床评分和MPO结果未见明显改变。BALB/c小鼠角膜经IL-17中和抗体预处理后，可以显著加重角膜炎，升高TNF-α、MIP-2蛋白水平以及MPO水平。C57BL/6小鼠角膜经中和抗体作用后角膜炎病程未见明显改变，MIP-2、 IL-1β、TNF-α蛋白的表达未见明显差异，MPO水平无明显改变。3、BALB/c小鼠角膜感染后角膜中Caspase3、Caspase8、Caspase9、Bcl-2、Fas、FasL基因和蛋白水平升高早于C57BL/6小鼠感染角膜中的表达，BALB/c小鼠感染后3天角膜中MerTK阳性细胞、巨噬细胞及MerTK阳性巨噬细胞明显多于C57BL/6小鼠角膜。C57BL/6小鼠经IL-17中和抗体处理后感染角膜中MerTK阳性细胞、巨噬细胞数升高，但差异无统计学意义。然而BALB/c小鼠经IL-17中和抗体处理后感染角膜中MerTK阳性细胞、巨噬细胞数以及MerTK阳性巨噬细胞比例显著降低。BALB/c小鼠经IL-10中和抗体处理后感染角膜中MerTK阳性细胞、巨噬细胞数未见明显改变。
　　结论：1、C57BL/6小鼠角膜铜绿假单胞菌性角膜炎感染后角膜中IL-17的表达高于BALB/c小鼠感染后角膜。感染后角膜中浸润的中性粒细胞和部分巨噬细胞可以产生IL-17。2、给予BALB/c小鼠重组IL-17蛋白并不能使其从抵抗型转为易感型，但是给予BALB/c小鼠IL-17中和抗体可以加重疾病，中和C57BL/6小鼠IL-17未显著改变疾病病程。3、BALB/c小鼠角膜感染后凋亡基因Fas和FasL升高早于C57BL/6小鼠。BALB/c小鼠角膜感染后3天表达较多的MerTK阳性细胞、巨噬细胞及MerTK阳性巨噬细胞。BALB/c小鼠角膜炎中凋亡的发生以及与吞噬凋亡细胞相关的MerTK阳性细胞、巨噬细胞及MerTK阳性巨噬细胞的升高均早于C57BL/6小鼠，与BALB/c小鼠抵抗型表现相一致。4、给予BALB/c小鼠IL-17中和抗体降低MerTK阳性细胞、巨噬细胞及MerTK阳性巨噬细胞数。IL-17中和抗体可以升高C57BL/6小鼠角膜中MerTK阳性细胞及巨噬细胞数，但并未显著改变疾病病程。给予BALB/c小鼠IL-10中和抗体未显著改变MerTK阳性细胞及巨噬细胞数。适量的IL-17在抵抗型BALB/c小鼠铜绿假单胞菌性角膜炎中通过升高MerTK阳性细胞、巨噬细胞数及MerTK阳性巨噬细胞比例起保护作用，该保护作用的发生不依赖于IL-10。

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引言

第一章 IL-17在C57BL/6和BALB/c小鼠铜绿假单胞菌角膜炎中的表达以及细胞来源

前言

1.1 材料与方法

1.2 结果

1.3 讨论

附图

第二章 BALB/c、C57BL/6小鼠铜绿假单胞菌性角膜炎中IL-17的功能

前言

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

附图

第三章 IL-17在铜绿假单胞菌性角膜炎中对MerTK阳性细胞、巨噬细胞和MerTK阳性巨噬细胞的调控作用

前言

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

附图

结论

参考文献

综述: IL-17在机体防御感染性疾病中的作用

一、IL-17家族的功能

二、IL-17信号转导

三、IL-17在感染性疾病中的细胞来源

四、IL-17与感染性疾病

五、结语与展望

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢

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