7,8-二羟基黄酮对缺氧诱导下肾小管上皮细胞内质网应激的抑制作用

摘要

目的：观察7,8-二羟基黄酮（7,8-dihydroxyflavone，7,8-DHF）对缺氧诱导的人近端肾小管上皮细胞内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）损伤的影响，并初步探讨其可能的分子机制。
　　方法：体外培养人近端肾小管上皮细胞（HK-2），采用缺氧培养箱建立细胞缺氧损伤模型，排除含血清培养基对缺氧的影响后，实验分为5组，分别为缺氧0h、4h、8 h、12 h、16 h组。实时荧光定量PCR（RT-PCR）法筛选缺氧诱导ERS的最佳缺氧时间。用不同浓度（50、100、150、200、250μmol/L）7,8-DHF处理HK-2细胞,采用细胞增殖与活性实验筛选7,8-DHF的安全浓度。用7,8-DHF预处理HK-2细胞缺氧模型，按如下处理因素分组：对照组、缺氧+DMSO组、缺氧+7,8-DHF组（包括100μmol/L组和150μmol/L组），通过检测细胞增殖与活性筛选最佳给药浓度。后将细胞随机分为缺氧组、缺氧+7,8-DHF组（100μmol/L），Western印迹法检测细胞蛋白激酶（Akt）、磷酸化蛋白激酶（p-Akt）、富含半胱氨酸蛋白61（Cysteine-rich protein61，Cyr61）、ERS相关促凋亡蛋白CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）的表达。用重组Cyr61慢病毒载体构建稳定表达Cyr61蛋白的Cyr61-HK-2细胞株进行缺氧实验，按如下处理因素分组：缺氧+空质粒转染组，缺氧+Cyr61过表达组，采用膜连蛋白V和碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）染色后采用流式细胞仪检测细胞凋亡，Western印迹检测Cyr61和CHOP蛋白的表达情况。
　　结果：（1）与正常培养组细胞相比，RT-PCR实验结果显示12 h为诱导ERS的最佳缺氧时间（P＜0.01）。（2）与对照组相比，细胞增殖与活性实验结果显示100μmol/L的7,8-DHF组为最佳给药浓度（P＜0.01）。（3）与缺氧+DMSO组相比，7,8-DHF预处理HK-2细胞，p-Akt、Cyr61表达量均明显增高（P＜0.05），CHOP表达量明显降低（P＜0.05）；LY294002处理可抑制p-Akt的表达，减少Cyr61及增加CHOP的表达（均 P＜0.05）。（4）与缺氧+空质粒转染组相比，过表达 Cyr61组细胞的凋亡率明显降低（P＜0.01）。（5）与缺氧+空质粒转染组相比，过表达Cyr61组的Cyr61表达量明显增高（P＜0.01），CHOP表达量明显降低（P＜0.01）。
　　结论：缺氧可诱导HK-2细胞发生ERS，7,8-DHF可能通过激活Akt通路上调Cyr61阻止ERS下游凋亡蛋白CHOP的活化，抑制细胞凋亡以及减轻缺氧诱导的HK-2细胞损伤，提示7,8-DHF可能对AKI发挥保护作用。

目录

引言

材 料 与 方 法

1 实验材料

1.1 实验细胞

1.2 实验试剂

1.3 主要仪器

2 实验方法

2.1总研究方案

2.2细胞培养和分组

2.3 药物毒性、细胞增殖及活性检测

2.4 细胞凋亡的检测

2.5 Western 印迹

2.6 实时荧光定量PCR

3 统计学分析

结果

2 7,8-DHF安全浓度检测及其对缺氧细胞活性的影响

3 7,8-DHF和PI3K/Akt抑制剂对Cyr61、Akt和p-Akt、CHOP 蛋白表达的影响

4 过表达Cyr61对细胞凋亡率的影响

5 过表达Cyr61对Cyr61和CHOP蛋白表达的影响

讨论

结论

参考文献

综述:7,8-二羟基黄酮与急性肾损伤的相关研究进展

攻读学位期间的研究成果

缩 略 词 表

附录

致谢

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