缺血后处理对脑缺血再灌注大鼠TLR4-TRIF信号转导途径的影响

摘要

目的：缺血后处理（ischemic post-conditioning, IPO）能够激发机体内源性保护作用，减轻缺血再灌注（ischemia reperfusion, I/R）后的炎症反应，但具体作用机制目前尚不明确。本课题旨在探讨 IPO对局灶性脑缺血再灌注大鼠 Toll样受体4（Toll-like receptor4, TLR4）- Toll/IL-1受体结构域接头分子（Toll-interleukin1 receptor domain-containing adapter-inducing interferon-b, TRIF）信号转导途径的影响，进一步阐述IPO的神经保护机制，为临床应用IPO治疗缺血性卒中提供理论依据。
　　方法：研究选用130只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠并随机分为假手术组（sham组）30只，模型组和干预组各50只，sham组根据手术后，模型组和干预组根据再灌注后时间点随机分为6h、12h、24h、48h和72h5个亚组，sham组每个亚组各6只，模型组和干预组每个亚组各10只。后两组采用Zea-longa线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。sham组仅手术暴露颈总动脉及分叉处，不阻断大脑中动脉。在再灌注开始时即模型建立后2h对干预组大鼠进行IPO处理（即术后2 h将栓线拔出至头部位于颈总动脉分叉处，10s后再将栓线置入初始位置10s，如此重复6次）。对模型组大鼠仅拔出栓线，不给予IPO处理。于再灌注后6h、12h、24h、48h、72h等时间点，采用Menzies法进行神经功能缺损评分；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC）染色观察脑梗死体积；原位末端标记法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）法检测缺血侧脑组织细胞凋亡；实时定量荧光 PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）检测大鼠缺血侧颞、顶叶皮质TLT4-TRIF信号转导途径的特异性结构分子及关键细胞因子 TLR4、TRIF、TRIF相关的接头分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)、干扰素调节因子3(interferon regulatory factor3, IRF-3)及β干扰素（interferon-β, INF-β）等的mRNA表达；免疫组织化学（immunohistochemistry）检测大鼠缺血侧脑组织中TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β等结构分子及关键细胞因子蛋白阳性细胞的分布与表达；免疫印迹法(western blotting)定量检测大鼠缺血侧颞、顶叶皮质中TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β等结构分子及关键细胞因子的蛋白表达。
　　结果：模型组、干预组大鼠都出现不同程度的神经功能缺损及缺血侧大脑半球梗死。相比模型组，干预组大鼠神经功能缺损评分得到显著改善（t=2.963～5.262，P＜0.05），脑梗死体积明显减少（t=3.341～3.875，P＜0.05），凋亡细胞计数明显减少（t=2.332～3.643，P＜0.05）。模型组和干预组TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-βmRNA和蛋白表达于再灌注6h时已显著升高。qPCR结果显示干预组TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及 IFN-β mRNA表达较模型组各对应时间点显著降低（t=2.240～6.587，P＜0.05），免疫组织化学检测结果显示TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β蛋白阳性细胞主要位于缺血侧额、颞叶皮质，干预组阳性细胞计数较模型组各对应时间点显著降低（t=2.256～8.180，P＜0.05）。Western blotting检测结果显示干预组 TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β蛋白表达较模型组各对应时间点显著降低（t=2.943～8.227，P＜0.05）。
　　结论：本研究证实IPO能够通过抑制细胞凋亡、减少脑梗死体积发挥神经保护作用，改善MCAO大鼠的神经功能。IPO还可能通过抑制TLR4-TRIF信号转导途径减少通路下游IRF-3、IFN-β等炎症相关因子的表达，减轻I/R后的局灶性炎症反应，进而激发内源性神经保护作用。

目录

引言

第1章 研究对象与模型建立

1.1研究对象与分组

1.1.1实验动物的选取

1.1.2实验分组

1.2模型建立

1.2.1材料

1.2.2方法

1.3 样本的提取与保存

第2章 形态学研究

2.1主要仪器

2.2主要试剂

2.3神经功能缺损评分

2.3.1方法与数据处理

2.3.2结果

2.4脑梗死体积的测定

2.4.1 方法与数据处理

2.4.2结果

2.5细胞凋亡检测

2.5.1石蜡切片的制备

2.5.2方法与数据处理

2.5.2 结果

第3章 检测目的基因与目的蛋白的表达

3.1实时定量荧光PCR

3.1.1主要仪器

3.1.2主要试剂

3.1.3方法与数据处理

3.1.4结果

3.2免疫组织化学

3.2.1主要仪器

3.2.2主要试剂

3.2.3方法与数据处理

3.2.4结果

3.3免疫印迹法

3.3.1主要仪器

3.3.2主要试剂

3.3.3方法与数据处理

3.3.4结果

讨论

结论

参考文献

综述:缺血后处理的神经保护作用机制与TLR4信号转导通路在脑缺血再灌注损伤中的作用

攻读学位期间的研究成果

致谢

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