氨苯砜斑贴试剂的研发与初步应用

摘要

研究背景：氨苯砜（dapsone, DDS）具有抗菌、抗炎双重效应，是治疗麻风病的基本药物并被广泛应用于疟疾、HIV感染所致的卡氏肺囊虫肺炎及多种慢性炎症性疾病的治疗。
　　氨苯砜化学名称为4,4’-对位氨基双苯砜，其分子量为248.31。氨苯砜口服吸收后在肝脏进行代谢，经细胞色素P450酶的作用，发生羟基化和乙酰化两个过程，代谢产物为羟胺氨苯砜和乙酰氨苯砜。羟胺氨苯砜在药物的药理作用及不良反应的产生方面起关键作用。其代谢产物在皮肤、心脏、肝脏和肾脏等全身多器官广泛分布。氨苯砜经口服后通过小肠吸收，口服2-8小时后达到血浆峰浓度。单次剂量50-300mg氨苯砜可到达血药浓度为0.63-4.82mg/L。在100mg/d的常规用量下，血浆峰浓度可达3.26 mg/L。约有20%的代谢产物直接经尿液排出，70-85%的代谢产物与葡萄糖醛酸共价结合后经尿液排出，此外，氨苯砜也可经胆汁排出体外。
　　氨苯砜最大的副作用在于部分患者服药后会发生一种严重的药物超敏反应，临床上表现为突然发生的丘疹或剥脱性皮疹，伴发热、淋巴结肿大、单核细胞增多及肝脏或造血系统功能受损，通常在服用氨苯砜4-6周后发生（故又称为“5周皮炎”），发生率为0.5％～3.6％，死亡率9.9%。该药物不良反应在1951年被正式命名为氨苯砜综合征。当前对于该综合征的诊断主要依据Richardus和Smith于1989年提出的诊断标准，即患者在服用氨苯砜后出现皮疹、发热、肝功能异常及淋巴结肿大中的2条或以上即可诊断。但上述诊断由于无有效的实验室诊断指标的支持，缺乏特异性，往往很难与疾病本身伴随的感染、炎症反应相鉴别，且对于疾病的治疗，患者往往会在同一时间段服用多种药物，这也导致致敏药物难以判定及准确停用，以致临床漏诊、误诊现象严重。
　　氨苯砜综合征是由T淋巴细胞介导的一种药物超敏反应，在机体首次接触致敏药物后，体内T淋巴细胞被激活致敏。当机体再次接触该药物后，致敏的T淋巴细胞活化增殖，释放细胞因子IFN-γ等，吸引和激活巨噬细胞，在局部产生以T细胞和巨噬细胞浸润为主的炎症反应。斑贴试验作为测定机体变态反应的一种辅助诊断方法即是基于以上原理产生，迄今在皮肤科的应用已有120多年的历史。目前国际上诊断临床常见的28种致敏药物（卡马西平、布洛芬、阿莫西林、双氯芬酸钠等）已研发了具有独立知识产权的斑贴试剂盒，已获得美国FDA、中国cFDA以及欧盟认证，在临床上广泛应用，为药物所致不良反应的诊断及鉴别诊断提供了有效的工具，获得了良好的社会经济效益。
　　研究目的：本研究旨在研发氨苯砜斑贴试剂，建立氨苯砜综合征免疫确证方法，为疾病的诊断提供有效技术手段，以推动该技术在临床上的应用。
　　研究对象：
　　1、氨苯砜综合征病例组：临床拟诊氨苯砜综合征并携带HLA-B*1301位点的麻风病患者24例。
　　2、氨苯砜综合征对照组：服用过氨苯砜并携带HLA-B*1301位点但未出现氨苯砜综合征的麻风病患者25例。健康志愿者50例。
　　纳入标准：
　　病例组：
　　1、2008.01-2016.12新发的麻风病患者且服用过氨苯砜进行治疗；
　　2、患者服用氨苯砜治疗过程中出现发热、皮疹、肝功能异常、淋巴结肿大等疑似氨苯砜综合症，符合Richardus和Smith提出的该病诊断标准；
　　3、携带HLA-B*1301等位基因；
　　4、同意参与本研究并签署书面知情同意书。
　　对照组
　　1、2008.01-2016.12全国新发的麻风病患者且服用氨苯砜进行治疗，服药时间至少1个月；
　　2、患者服用氨苯砜治疗过程中未发现发热、皮疹、肝功能异常、淋巴结肿大等临床症状；
　　3、携带HLA-B*1301等位基因；
　　4、同意参与本研究并签署书面知情同意书。
　　排除标准：
　　1.对磺胺类、呋塞米类、噻嗪类、磺酰脲类以及碳酸酐酶抑制药过敏的患者；
　　2.无法提供正确信息的患者，如精神障碍等；
　　3.并发严重疾病的患者，如心衰、恶性肿瘤等；
　　研究内容：本研究分为三部分：
　　研究I：研发可供临床应用的氨苯砜综合征斑贴试剂，探索稳定的试剂基质及浓度范围并明确其稳定性情况：以临床诊断和激发试验阳性的1例疑似氨苯砜综合征患者为实验对象，探索氨苯砜斑贴试剂合适的基质及浓度范围；
　　研究II：对配置的斑贴试剂进行含量测定，明确试剂的稳定性情况；
　　研究III：明确氨苯砜斑贴试剂临床应用的敏感度及特异度：对临床拟诊且携带HLA-B*1301位点的23例疑似氨苯砜综合征患者及25例服用氨苯砜且携带HLA-B*1301位点但未出现疑似氨苯砜综合征症状的25例麻风病患者采用建立的斑贴试剂进行检测。选择50例健康志愿者用于排除斑贴试剂本身所致的皮肤刺激反应。使用卡方检验用于确定各组间差异的统计学意义，确定研发的斑贴试剂临床应用的敏感度及特异度情况。
　　研究方法：
　　研究I：采用溶解法观察凡士林基质、聚乙二醇200基质、聚乙二醇200基质+二甲基亚砜、聚乙二醇基质+油酸、聚乙二醇基质+氮酮在氨苯砜中的溶解程度，并根据斑贴试验结果调整斑贴试剂的浓度；
　　研究II：采用高效液相色谱仪对配制的凡士林基质、聚乙二醇200基质的斑贴试剂进行含量测定，同时对其初步的稳定性情况进行考察；
　　研究III：对研究对象进行氨苯砜斑贴试验，方法如下：
　　1.将氨苯砜斑贴试剂按0.1%、0.5%、1%、5%、10%、15%、20%、25%的浓度摆放好，把对照放好。
　　2.将斑试器从带有三角撕口的一侧撕开，然后将氨苯砜斑贴试剂及空白对照按顺序加在斑试器上。注意记录斑贴试剂的浓度顺序。
　　3.让患者充分暴露背部皮肤，选择无皮疹、无色素沉着的正常皮肤进行试验。
　　4.用酒精棉球对皮肤进行充分消毒，然后将斑试器贴在患者后背皮肤上，轻压排净空气，将斑试器贴牢。
　　5.用记号笔在斑试器的四角做好标记。并在实验记录纸上做好记录，特别注意记录斑贴试剂不同的浓度的位置。
　　6.嘱咐患者在48小时后撕掉斑试器，试验期间不宜洗澡、不宜干农活、不宜剧烈运动、不宜饮酒等。试验期间若发生强烈反应需撕掉斑试器。
　　7.72小时后，也就是撕掉斑试器24小时后观察实验结果。用酒精棉球擦拭清洁受试部位，再次用记号笔对斑试器的四个角进行标注，仔细观察受试部位有无红斑、丘疹、水泡出现（部分患者实验效果不明显，需仔细观察)。根据国际接触性皮炎研究组ICDRG(International Contact Dermatitis Research Group)指南判读结果。斑贴试验结果均由同一技术人员判定。
　　统计学方法：
　　研究结果分析在意向性分析(intention to treat，ITT)人群进行，ITT人群是指所有进入研究并至少有过一次用药措施的受试者。数据统计应用SPSS16.0版软件，根据研究目的和资料的性质选用卡方检验，得出试验组与对照组的各项指标差异是否有统计学意义。所有统计检验均采用双侧检验，检验水准定义为α=0.05，P值小于0.05将被认为所检验的差别有统计学意义。
　　研究结果：
　　研究I：经过氨苯砜凡士林基质、聚乙二醇200基质、聚乙二醇200基质+二甲基亚砜、聚乙二醇基质+油酸、聚乙二醇基质+氮酮5种基质的比较，最终选择聚乙二醇200基质+二甲基亚砜做为最佳制剂。
　　研究II：采用聚乙二醇200作为基质的斑贴，常温状态以及4℃低温放置6个月样品含量无明显下降趋势，且低温保存与常温保存对样品稳定性无差异，采用此基质可保证样品在一定时间内稳定，无需现用现配。
　　研究III：在全国范围内对23例氨苯砜综合征患者做斑贴试验，其中10例斑贴试验阳性，13例斑贴试验阴性。服用过氨苯砜且未出现氨苯砜综合征的麻风病患者25例氨苯砜斑贴试验均阴性，健康志愿者50例氨苯砜斑贴试验均阴性。
　　结论：本研究建立了基于斑贴实验的氨苯砜综合症免疫确证方法，为该病的精准诊断提供了有效的实验室技术手段，也将为其他药物所致药物超敏反应综合征的免疫确证方法的建立提供思路与借鉴，对于在临床实践中判定患者的致敏药物、明确疾病诊断具有重要意义。

目录

引言

1 氨苯砜斑贴试剂的制备

1.1实验材料与仪器设备

1.2 实验对象

1.3 实验方法及结果

2 氨苯砜斑贴试剂的含量测定及稳定性研究

2.1 实验材料与仪器设备

2.2 凡士林基质斑贴含量测定

2.3 聚乙二醇200基质的斑贴含量测定

3 氨苯砜斑贴试剂的初步应用

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 研究对象

3.4 实验结果

3.5 讨论

3.6 结论

参考文献

综述:伴嗜酸粒细胞增多和系统症状的药疹（DRESS）

1.DRESS的概念

2.流行病学

3.病因与发病机制

4.伴嗜酸粒细胞增多和系统症状的药疹的临床表现和实验室检查

5 诊断标准

6 治疗

7 预防

参 考 文 献

攻读学位期间的研究成果

致谢

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