转运表阿霉素的肝靶向肿瘤微环境响应的多级纳米粒的制备与评价

摘要

肿瘤靶向的纳米载体药物是治疗实体瘤的手段之一，可以提高药物在肿瘤组织和肿瘤细胞的分布。然而实体瘤由于坚实的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）以及较高的肿瘤内流体压力（interstitial fluid pressure，IFP），限制了药物向实体瘤内部的渗透。为解决向实体瘤内部持续输送纳米药物的问题，本研究制备了一种肿瘤微环境响应的多级纳米载体，用以靶向递送抗肿瘤药物表柔比星，其特征为：通过自由基加成断裂链转移(RAFT)聚合反应合成两亲性三嵌段聚合物：聚乙二醇-聚（2-二异氨基甲基丙烯酸乙酯）-聚（2-胍乙基甲基丙烯酸酯）（PEDG，mPEG-PDPA-PG），其与表柔比星（Epirubicin，EPI）形成载药胶束（NPs-EPI）；再以促渗透肽iRGD修饰的明胶(G-iRGD)作为载体，通过静电作用与载药胶束和透明质酸酶（Hyaluronidase，HAase）形成多级纳米粒（MGNPs）。 合成的聚合物通过核磁共振、凝胶渗透色谱进行结构鉴定；利用透射电镜观察其形态；马尔文激光粒度仪观察其粒径及电位；采用酶标仪测定NPs-EPI的载药量及包封率；采用透析法考察NPs-EPI在不同pH条件下的药物释放情况。采用MTT法考察NPs-EPI和纳米递送系统NPs-EPI/HAase/G-iRGD对人肝癌细胞HepG2细胞存活率的影响；建立体外3D肿瘤球模型,利用激光共聚焦显微镜层扫肿瘤球考察HAase对于实体瘤组织渗透性的影响；采用荧光标记法Lyso Tracker-Green DND-26标记溶酶体，考察NPs-EPI在HepG2细胞内的分布以及溶酶体逃逸现象；采用流式细胞技术考察HepG2细胞对NPs-EPI/G以及NPs-EPI/G-iRGD的摄取效率。建立荷HepG2瘤裸鼠模型，利用冷冻切片技术考察HAase对于实体瘤组织渗透性的影响，同时利用活体成像技术考察NPs-EPI、NPs-EPI/G、NPs-EPI/G-iRGD的体内分布。 核磁和凝胶渗透色谱结果表明成功合成了各目标产物；NPs-EPI呈规则的球型，其平均粒径为85.1±0.2nm,平均电位为39.9±0.6mv；载药胶束对EPI的载药量及包封率分别为4.4%和31.7%；NPs-EPI分别在pH为7.4和5.5的磷酸盐缓冲溶液中孵育72h，EPI的累积释放率分别为50%以及82%，呈现出一定的pH依赖性；MTT实验结果表明纳米递送系统NPs/HAase/G-iRGD无明显细胞毒性，细胞相容性良好；体外肿瘤球渗透性实验以及体内肿瘤冷冻切片结果表明NPs-EPI/HAase的荧光强度要明显高于NPs-EPI均说明HAase可以降解细胞外基质的透明质酸，有利于载药胶束更好的渗透进入实体瘤内部；胞内分布实验结果表明随着NPs-EPI给药时间的延长，NPs-EPI可以从溶酶体逃逸出来，发挥抗肿瘤作用；流式结果表明NPs-EPI/G-iRGD比NPs-EPI/G更容易被HepG2所摄取，表明iRGD具有一定的主动靶向作用；活体成像结果表明NPs-EPI/G-iRGD相比NPs-EPI、NPs-EPI/G更容易富集于肝脏中，并随着给药时间延长在肿瘤内有一定的富集。本研究所制备的多级纳米载体能够有效的将EPI递送到实体瘤内部，提高实体瘤低渗透性从而发挥抗肿瘤的效果。

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