苦豆子内生放线菌多样性及其抗生素合成酶基因的挖掘

摘要

植物内生放线菌是指生活在植物体内或在其生活史的一定阶段处于植物体内的一类放线菌，普遍存在于目前发现的各种陆生及水生植物中。不同的气候条件、区域或位点、植被等都可以影响内生放线菌的多样性。已有研究发现药用植物内生放线菌作为一类新的微生物资源具有很好的开发潜力、药用价值及潜在的商业价值，这些内生放线菌与宿主之间的生态关系极为紧密，它们所产生的次生代谢产物在植物病虫害生物防治、医药等方面的用途正在逐渐增大，已经成为寻找新的天然活性产物的重要途径。本文以宁夏白芨滩自然保护区的沙生药用植物苦豆子为研究对象，利用生物学、分子生物学和化学指纹分析，进行了内生放线菌多样性分析;抑菌活性菌株的筛选;抗生素PKS和NRPS功能基因菌株的挖掘以种类鉴定，并对功能菌株产生的抗生素类型进行高效液相色谱分析。研究结果如下:
　　1、从宁夏白芨滩国家级自然保护区不同植被和土壤类型的6个样区采集健康的苦豆子样品30份，从中共分离得到111株内生放线菌。内生放线菌数量分布以根部最多，其次为种子，叶部最少;土壤类型为淡灰钙土时苦豆子内生放线菌数量比土壤类型为风沙土时多;结合形态学特征和16S rDNA序列分析表明，111株内生放线菌分属于9个属，以链霉菌属（Streptomyces）和拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）为优势属，其中链霉菌属（Streptomyces）在各样区中均有分布。而普劳斯氏菌属（Prauserella）、Actinophytocola、微杆菌属（Microbacterium）、糖丝菌属（Saccharothrix）、束丝放线菌属(Actinosynnema)、糖霉菌属（Glycomyces）和嗜热油菌属（Thermoleophilum）都为稀有属。
　　2、以15种植物病原真菌为靶标菌，对19株苦豆子内生放线菌抑菌活性菌株进行进一步的抗菌活性筛选。采用皿内对峙培养法培养7d左右观察结果，结果表明17株菌株对番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)都有抑菌活性;16株菌株对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solan）和小麦赤霉病菌（Fusarium graminearm）具有抑菌活性。其中菌株YWZKDS4对白菜黑斑病菌（Alternariajaponica）的抑菌圈半径最大达到17.58 mm; YCZKDS4对水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)的抑菌圈半径最大达到15.62 mm。制备菌株YWZKDS4发酵液直接喷施于葡萄炭疽病果，进行田间测试，结果发现菌株YWZKDS4的平均防效为61.27％。
　　3、设计放线菌抗生素聚酮合成酶基因PKSⅠ和PKSⅡ和非核糖体多肽基因NRPS引物，对19株苦豆子高活性抑菌菌株进行特异性扩增。结果表明共有11株菌株为阳性菌株，PKSⅠ基因阳性菌株率为47.4％，PKSⅡ基因阳性菌株率为10.5％，NRPS基因阳性菌株率为21.1％。根据菌株形态特征和系统发育分析，阳性菌株中有10株属于链霉菌属（Streptomyces），只有1株属于拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis）。
　　4、对11株PKSⅠ、PKSⅡ和NRPS基因阳性菌株产抗生素进行薄层色谱和高效液相色谱分析。结果表明供试的9株菌株能产生麦迪霉素(MDM)，菌株YWZKDS3能产生麦迪霉素(MDM)、乙酰螺旋霉素(AEM)、克拉霉素(CAM)和四环素(TC)4种抗生素，菌株NDZKDS69能产生麦迪霉素(MDM)、乙酰螺旋霉素(AEM)、土霉素(OTC)和替考拉宁(TIL)4种抗生素。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1．1 放线菌及其产生抗生素的研究

1．1．1 放线菌分类

1．1．2 放线菌产生抗生素研究

1．2 植物内生放线菌

1．3 植物内生放线菌多样性

1．3．1 植物内生放线菌物种的多样性

1．3．2 植物内生放线菌宿主植物的多样性

1．3．3 植物内生放线菌分离部位多样性

1．4 植物内生放线菌产生次生代谢产物多样性

1．4．1 植物内生放线菌产生的抗生素类活性物质

1．4．2 植物内生放线菌产生的非抗菌类活性物质

1．5 植物内生放线菌的生物活性

1．5．1 抗菌活性

1．5．2 抗癌活性

1．5．3 促进植物生长

1．5．4 产酶活性

1．5．5 其它类

1．6 现代生物学技术在植物内生放线菌研究中的应用

1．6．1 植物内生放线菌分类鉴定方法

1．6．2 化学指纹图谱技术的应用

1．7 苦豆子及其内生放线菌研究

1．7．1 苦豆子研究概况

1．7．2 苦豆子内生放线菌

1．8 本研究的目的、意义与内容

第二章 苦豆子内生放线菌多样性及其生态分布

2．1 材料和方法

2．1．1 材料

2．1．2 主要试剂和仪器

2．1．3 培养基

2．1．4 内生放线菌的分离和培养

2．1．5 苦豆子内生放线菌的形态学鉴定

2．1．6 苦豆子内生放线菌分子生物学鉴定

2．1．7 统计方法

2．2 结果与分析

2．2．1 苦豆子内生放线菌的组成

2．2．2 苦豆子内生放线菌分布的差异性

2．2．3 苦豆子内生放线菌系统发育分析

2．3 讨论

第三章 苦豆子内生拮抗放线菌菌株的筛选及其抑菌高活性菌株鉴定

3．1 材料和方法

3．1．1 试验材料

3．1．2．内生拮抗放线菌筛选

3．1．3 拮抗菌田间防效试验

3．1．4 优良拮抗菌株的鉴定

3．2 结果与分析

3．2．1 苦豆子内生放线菌抑菌活性测定

3．2．2 菌株YWZKDS4发酵液大田防治效果

3．2．3 优良菌株YWZKDS4的鉴定

3．3 讨论

第四章 苦豆子内生拮抗放线菌的鉴定及其抗生素合成基因的筛查

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 培养基

4．1．3 拮抗菌鉴定及系统发育分析

4．1．4 抗生素生物合成途径关键酶基因的筛查

4．2 结果与分析

4．2．1 19株抑菌高活性菌株鉴定及其系统发育分析

4．2．2 PKSⅠ、PKSⅡ和NRPS基因阳性菌株筛选

4．3 讨论

第五章 TLC和HPLC法同时测定苦豆子内生放线菌产生抗生素种类

5．1 材料和方法

5．1．1 材料

5．1．2 仪器与试剂

5．1．3 方法

5．2 结果与分析

5．2．1 抗生素合成酶基因内生拮抗菌筛选及其鉴定

5．2．2 TLC法初检

5．2．3 HPLC法检测抗生素种类

5．2．4 抗生素线性关系考查

5．2．5 发酵液中抗生素含量测定

5．2．6 精密度试验

5．2．7 稳定性试验

5．2．8 回收率试验

5．3 讨论

小结

参考文献

致谢

作者简介