冬凌草甲素诱导U937细胞凋亡及增强吞噬凋亡小体的机制研究

摘要

本文对冬凌草甲素体外诱导人组织淋巴瘤U937细胞死亡机制及增强U937来源的吞噬细胞对紫外(UV)照射诱导的凋亡小体吞噬的机制进行了系统的研究。 实验结果表明，冬凌草甲素对U937细胞有明显的细胞毒活性，抑制细胞生长呈明显的时间和剂量依赖性。形态学方法、核荧光染色及DNA片段化分析实验证实了冬凌草甲素诱导U937细胞死亡机制为诱导细胞凋亡。 U937细胞对27μmol·L<'-1>的冬凌草甲素及Fas激动型抗体CH11 500 ng／ml(作为细胞对Fas敏感性的阳性对照)表现为凋亡敏感性，在研究上游启动凋亡的caspase中，caspaSe 8特异性抑制剂z-IETD有效地阻断了冬凌草甲素诱导的细胞死亡和DNA片断化，但caspase 1特异性抑制剂Ac—YVAD和caspase 10特异性抑制剂z-AEVD对其没有影响。免疫印迹法显示Fas、FasL和FADD表达上调，caSpaSe 8前体降解，提示Fas／FasL途径参与冬凌草甲素诱导的U937细胞凋亡。冬凌草甲素和CH11诱导ERK MAPK活化，然而ERK特异性抑制剂PD98059逆转了冬凌草甲素诱导的U937细胞死亡和caspase 8前体降解，说明ERK在caSpase 8上游调控。另外，抑凋亡蛋白Bc1-2和Bc1-X<,L>表达降低，促凋亡蛋白BaX表达增加及细胞色素c释放，同时，caspase-3的酶原被降解，caspase-3底物ICAD(inhibitor of caspase activated DNase)和PARP(poly-(ADP-ribose)polymerase)降解。然而，PD98059逆转了冬凌草甲素对Bcl-XL、Bax和细胞色素c的影响，但对下调的Bc1-2表达没有作用。这些结果说明冬凌草甲素活化的Fas／FasL途径激活的ERK促进了U937细胞对线粒体途径诱导的凋亡敏感性。 1.35 lxmol·L<'-1>的冬凌草甲素具有增强U937分化的巨噬细胞对UV照射(52.1J／m<'2>)诱导凋亡的U937细胞的吞噬作用，并呈时间剂量依赖性。加入抗TNFα和抗IL-1β的抗体，培养12 h，吞噬增强作用明显受抑制，说明TNFα和IL-1β促进了冬凌草甲素增强的吞噬。另外，冬凌草甲素在人外周血来源的巨噬细胞吞噬凋亡死的U937细胞过程中同样发挥增强吞噬的效果。这些结果说明冬凌草甲素通过诱导TNFα和IL-1β释放增强U937细胞对凋亡小体的吞噬，这种作用可能有利于冬凌草甲素的抗肿瘤活性。 进一步研究发现，冬凌草甲素诱导的吞噬刺激受几种蛋白的特异性抑制剂所抑制，包括：磷脂肌醇3磷酸激酶(PI3-K)家族特异性抑制剂wortmannin、蛋白激酶C(PKC)家族特异性抑制剂stauroporine和磷脂酶C(PLC)特异性抑制剂U73122。冬凌草甲素与U937细胞作用不同时间后，引起PKC活力升高，但被wortmannin和stauroporine抑制。同时，wortmannin阻断了蛋白激酶B(PKB／Akt)的活化和PLCγ2表达的上调。另外，ERK特异性抑制剂PD98059抑制了冬凌草甲素诱导的吞噬刺激，但p38 MAPK特异性抑制剂SB203580和c-JuIl N-terminal kinase(JNK)MAPK特异性抑制剂SP600125没有影响。而且，抗TNFα和抗IL-1β的抗体预处理细胞后，抑制了吞噬增强作用和ERK的磷酸化，但对PKC活力没有影响，说明冬凌草甲素直接活化了以上的信号分子，而分泌的TNFα和IL-1β仅作用于ERK途径发挥调节吞噬的作用。Ras和Raf1kinase抑制剂明显抑制了冬凌草甲素增强的吞噬以及ERK的磷酸化。同时，核转录因子(NF)-kB特异性抑制剂PDTC和蛋白消化体(proteasome)特异性抑制剂MG132部分抑制了冬凌草甲素诱导的吞噬刺激。进一步研究发现冬凌草甲素诱导IrBα降解，而Ras抑制剂manumycinA和ERK抑制剂PD98059阻断了其降解，但JNK MAPK抑制剂SP600125没有影响；冬凌草甲素上调了IL-1β前体表达。这些结果说明冬凌草甲素激活的Ras／Rafl／ERK信号途径促进了IrBα降解，导致NF-kB活化，其效应功能之一是诱导IL-1β的产生，从而部分地促进了冬凌草甲素增强吞噬的能力。

目录

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摘要

第一章绪论

第二章冬凌草甲素诱导人组织淋巴瘤U937细胞死亡机制研究

第三章冬凌草甲素增强对凋亡小体吞噬作用的机制研究

一、实验部分

二、实验结果

三 讨论

四 小结

参考文献

缩略语说明

致谢

附录