牛病毒性腹泻病毒宁夏地方分离株的分离及其E0基因原核表达载体的构建

摘要

牛病毒性腹泻/黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）是由牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(BVDV)引发的牛的一种传染病。该病主要发生于牛，犊牛更易感，还可感染其它动物，主要引起牛腹泻，急、慢性粘膜病，持续性感染与免疫耐受，母畜流产和死胎等，给养牛业的经济造成严重的损失。为了调查宁夏地区牛病毒性腹泻/粘膜病的流行病学及分子流行病学情况，掌握该病在宁夏地区的流行状况，本试验运用ELISA方法对宁夏BVDV的感染及流行情况进行调查。并在此基础上对血清学阳性牛进行分子生物学跟踪检测，以获得BVDV地方分离株。
　　本研究对送到实验室检测的326份血清样品和278份耳组织样品，运用BVDV抗体ELISA检测试剂盒对血清样品进行抗体检测，对耳组织样品使用BVDV抗原ELISA检测试剂盒进行抗原检测。对送检样品BVDV血清学的研究。检测结果显示，326份血清样品的BVDV抗体阳性率为90.2％，278份耳组织样品的BVDV抗原阳性率为0.3％。检测结果表明宁夏地区送检的样品中BVDV抗体阳性率很高，可能是因为送检的都是具有腹泻、流产等症状的样品有关。
　　利用细胞培养技术对诊断出的抗原阳牛进行病毒分离，并顺利获得牛病毒性腹泻病毒分离株，命名为BVDV-NX。该分离株在MDBK细胞系上进行增殖培养，出现空斑、拉网和脱落等一系列典型的细胞病变(CPE)。随后收集病毒液，提取病毒总RNA并经反转录获得BVDV-NX毒株cDNA。利用PCR方法对5’-UTR基因片段进行扩增和测序，应用MEGA6分析软件，选择N-J(Neighbor-Joining)方法绘制遗传进化树，这株BVDV-NX属于BVDV基因1b型。
　　根据NCBI上已发表的BVDV-E0基因序列设计一对特异性引物，利用PCR方法扩增出710bp的E0基因，进行测序及序列分析。将PCR扩增的E0基因克隆入原核表达载体pET-32a，转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行双酶切鉴定，构建原核表达载体pET-32a-E0，为进一步的试验奠定基础。

目录

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论文说明

摘要

英文缩略词表

第一章 综述

1．1 BVD病原学

1．2 BVD流行病学

1．3 BVD的临床特征

1．4 BVD的诊断

1．5 BVD的防控

1．6 本研究的目的及意义

第二章 宁夏地区牛病毒性腹泻／黏膜病的血清学调查

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．3 结果与分析

2．4 讨论

第三章 牛病毒性腹泻病毒地方分离株分离与序列分析

3．1 材料

3．2 试验方法

3．3 结果与分析

3．4 讨论

第四章 牛病毒性腹泻病毒分离株BVDV-NX E0基因的原核表达载体的构建

4．1 材料

4．2 方法

4．3 结果

4．4 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

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