两种天然倍半萜的抗肿瘤活性及其生合成中酶的基因克隆

摘要

抱茎苦荬菜[Crepidiastrum sonchifolium(Bunge)]是菊科苦荬菜属植物，盛产于我国东北、华北。其化学成分复杂多样，其中的倍半萜内酯类化合物有显著的生物活性。 本文利用大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析等方法从抱茎苦荬菜中分离出含有两个活性倍半萜内酯苷成分的组合物并应用制备高效液相色谱，最终得到两个单一成分的化合物。利用光谱分析对二者进行结构鉴定，认定其分别为1(10),3,11(13)-愈创木三烯-12,6-内酯-2-酮-3-O-吡喃葡萄糖苷(苷1)和1(10),3-愈创木二烯-12,6-内酯-2-酮-3-O-吡喃葡萄糖苷(苷2)。 在活性内酯苷组合物的基础上，将葡萄糖基水解掉，成为内酯苷元组合物，再通过乙酸乙酯萃取，氧化铝柱层析等方法将组合物分离，分别得到两个苷元的单体。利用光谱分析对二者进行结构鉴定，认定其分别为3-羟基-1(10),3,11(13)-愈创木三烯-12,6-内酯-2-酮(苷元1)和3-羟基-1(10),3-愈创木二烯-12,6-内酯-2-酮(苷元2)。 将分离得到的四种化合物进行体外抗肿瘤活性实验。首先利用MTT法，测定它们对肿瘤细胞(A375-S2，Hela和L929)的细胞毒活性。结果表明，内酯苷和苷元对三种细胞都显示出了一定的增殖抑制活性，其中内酯苷元诱导上述细胞死亡呈剂量依赖关系且活性明显高于内酯苷。形态学方法表明内酯苷元组合物诱导A375-S2细胞，HeLa细胞和L929细胞的死亡机制为诱导细胞凋亡。 为研究苷元所诱导的细胞毒活性的机制，本文利用猿猴病毒(SV40)体外DNA复制系统检测了苷元对DNA复制过程的抑制作用，发现苷元1和2均能剂量依赖性地抑制SV40体外DNA复制。为探讨苷元是否通过抑制复制反应所需要的重要的复制蛋白来抑制DNA复制，本文检查了苷元对复制蛋白A(RPA)的单链DNA结合活性的影响。结果表明，苷元1能够剂量依赖性地抑制RPA与单链DNA的结合能力。在浓度达到250umol/L的时候，超过70％的RPA的单链DNA结合能力被抑制。 为了检测苷元抑制细胞增殖是否通过调节细胞周期的作用，我们利用流式细胞术检测了苷元对A549细胞的细胞周期的影响。结果表明，苷元能够诱导细胞周期阻滞在G2/M期。 在活性倍半萜内酯合成过程中存在着一个重要前体吉玛烷A，由吉玛烷A合成酶(Germaerene A synthase)催化合成，它也是许多植物抗毒素生物合成过程中与酶结合的中间产物。本文利用已知的倍半萜合成酶的保守氨基酸序列来设计简并引物，采用RT-PCR和RACE技术，首次从抱茎苦荬菜中克隆出吉玛烷A合成酶(CsGAS)基因的全长cDNA。该eDNA含有1837个核苷酸，包括1677 bp的开放阅读框架，编码559个氨基酸。将推导出的氨基酸序列进行序列分析时，我们选择能够产生中间产物吉玛烷A且晶体结构已知的烟草epi-aristolochene合成酶(TEAS)作为参照，讨论了可能对于倍半萜合成酶的催化产物特异性起作用的一些氨基酸序列。 利用载体pET-32a构建高效表达质粒pET32a-GAS，转化Ion和ompT蛋白酶缺陷株Escherichia coli BL21(DE3)来表达目的蛋白。对转化菌株的SDS-PAGE分析结果显示：该基因获得高效表达。

目录

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摘要

缩略语说明

第一章绪论

第二章 抱茎苦荬菜中倍半萜内酯苷及其苷元的抗肿瘤活性研究

第三章抱茎苦荬菜中吉玛烷A合成酶的基因克隆与体外表达

结论

参考文献

附图

致谢

附录