基于TBSV的植物RNA病毒表达载体的优化

摘要

植物RNA病毒载体表达系统是近年发展起来的一类有潜力的新型外源基因表达平台，目前构建新型植物RNA病毒表达载体的理想材料之一是番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus，TBSV)。本实验室以番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus，TBSV)为实验材料，前期研究结果表明，基于TBSV的病毒表达载体可以通过农杆菌转入到寄主植物中表达外源基因GFP，但是其表达效率还处于一个相对较低的水平，针对上述问题，基于TBSV的植物RNA病毒载体，我们希望通过探索TBSV载体中外源基因GFP插入位点上、下游相关序列对病毒载体表达效率的影响，优化相关TBSV病毒载体的结构，获得高效表达的TBSV病毒表达载体。
　　在TBSV病毒表达系统的优化过程中，首先，为了探索翻译起始位点AUG位置对TBSV病毒载体表达效率的影响，在载体pTBSV-WY2.0的基础上，设计并构建了融合型的表达载体pTBSV-WY2.1。利用农杆菌渗滤法接种于寄主烟草新品种(N.ecelsiana）后，依次进行整株、蛋白质、核酸等分子水平的比较研究结果显示，翻译起始位点AUG位置对病毒载体表达效率存在着显著的影响，且翻译水平上的变化是两载体间表达量差异的主要原因。此外，TBSV病毒基因组RNA在第8天时迅速降解，推测是病毒诱导的基因沉默(VIGS)所导致的，于是这也就对P19基因的恢复奠定了一定的基础。第二，为了探索p19基因在宿主植物Nexcelsiana中是否会造成宿主的枯死以及是否能够进一步提高病毒表达载体对外源基因表达的持续性和效率，在pTBSV-WY2.1载体的基础上恢复了P19基因沉默抑制子，分析结果表明，p19基因产物对更换后的宿主植物N.excelsiana无不良的影响;p19基因在表达持续时间和表达效率上对病毒载体有显著的增强作用;且顺式方式的p19基因的增效作用更明显。第三，为了进一步明确起始密码子AUG上游侧翼序列本身及其位置对病毒载体表达效率的作用，在载体pTBSV-WY2.0-P19的基础上，设计了四种不同的病毒载体，实验结果表明，起始密码子AUG上游侧翼序列及其长度对载体表达效率无显著影响，推测序列位置对TBSV载体表达效率可能起着关键性的作用。第四，为了探索局部结构(Local hairpin)替代RNA-RNA长距离互作对sg mRNA2转录的可行性和sg mRNA2转录水平对病毒载体表达效率的影响，选择合适的局部结构（比如G4结构，Hairpin茎环结构）替代TBSV中sg rnRNA2转录过程中复杂的长距离互作，优化设计了3个相关病毒载体，实验结果表明，sg mRNA2转录水平对病毒载体表达效率有着直接的影响，推测这种影响与sg mRNA2编码的两个病毒基因产物直接相关。第五，为了探索对外源基因GFP下游的CP基因序列不同长度对病毒载体表达效率的影响，优化设计并成功构建了3种病毒载体，从ELISA的定量结果来看，3'末端CP基因序列的不同长度与外源基因GFP的表达量呈负相关关系;第六，以Mfold软件预测的二级结构为导向，分别设计了两个植物病毒表达载体dATGdC和mATGdC，用以探索sg mRNA1二级结构对病毒载体表达效率的影响。接种寄主植物后的实验结果表明，sg mRNA1二级结构对病毒载体表达效率的确有一定程度的影响;推测，除了Y型结构域外，可能还存在其他的二级结构也在发挥着作用。最后，为了提高融合载体pTBS V-WY2.1-P19在后期应用中的便捷性，在载体的外源基因插入位点前加入了酶切位点FspⅠ构建新的病毒载体pTBSV-WY2.1-F SP，通过实验比较分析表明，就外源基因GFP的表达量而言，我们构建的两种TBSV病毒载体(pTBSV-WY2.1-FSP和dATGdC)达到了令人满意的效果，初步说明构建的病毒表达载体具有进一步应用的基础。而且融合型载体pTBSV-WY2.1-FSP的表达量在接种后第10天GFP的表达量达到5.0 mg/g鲜叶左右;非融合型载体dATGdC的表达量达到了每克鲜叶3.0 mg左右的水平。
　　本文通过改善或解决前期实验室构建的TBSV病毒表达载体表达效率相对较低的问题，为其进一步的应用奠定一定的基础。同时，通过相关机理研究，深入了解植物RNA病毒表达系统，为其他植物RNA病毒表达载体的设计提供参考。

目录

声明

摘要

中文缩略词表

第一章 文献综述

1．2 基于TBSV的植物RNA病毒表达载体的优势与限制

1．2．1 TBSV病毒表达载体的优势

1．2．2 TBSV病毒表达载体的局限性

1．2．3 当前TBSV病毒表达载体系统存在的问题

1．3 与TBSV病毒表达载体优化设计相关的分子生物学研究进展

1．3．1 TBSV病毒基因组RNA的有关翻译机制

1．3．2 5’非编码区(5’-UTR)的结构功能

1．3．3 TBSV病毒亚基因组(sg mRNAs)的转录对表达效率的影响

1．3．4 项目研究目的和意义

第二章 基于TBSV的病毒表达载体的优化及其在烟草中的表达分析

2．1 材料与试剂

2．2 分子生物学实验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 翻译起始位点AUG位置对病毒载体表达效率的影响分析

2．3．2 p19基因对病毒载体表达效率的影响

2．3．3 起始密码子AUG上游侧翼序列及位置对病毒载体表达效率的影响分析

2．3．4 sg mRNA2转录水平对病毒载体表达效率的影响

2．3．5 外源基因下游的CP基因序列长度对病毒载体表达效率的影响

2．3．6 sg mRNA1二级结构对病毒载体表达效率的影响

2．3．7 TBSV病毒载体与其他植物病毒表达载体的初步比较研究

2．4 讨论

第三章 主要研究结果与结论

参考文献

附录

致谢

个人简介