骨疏丹原料药材指纹图谱及复方体内活性成分分析

摘要

骨疏丹处方是基于传统中医学和现代医学对骨质疏松症的认识，利用“中药小复方精选系统操作技术平台”及“《普济方》数据库管理系统”精心拟定而成。骨疏丹方剂由淫羊藿、蛇床子、骨碎补和丹参四味中药组成。 本文建立了复方骨疏丹原料药材的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，色谱柱为Diamonsil<'TM>C<,18>，检测波长为270 nm，柱温为25℃，流速为1.0 mL·min<'-1>骨碎补，淫羊藿指纹图谱流动相均为乙腈-0.4％醋酸水溶液，蛇床子指纹图谱流动相为乙腈-水，采用梯度洗脱。结果表明，淫羊藿用聚类分析可归为两类，朝鲜淫羊藿共得到23个共有峰，相似度0.8以上；骨碎补得到8个共有峰，相似度0.9以上；蛇床子得到7个共有峰，相似度0.9以上。可有效控制药材质量。 本论文应用本实验室建立的成骨样细胞UMR106活性检测技术，以促进成骨细胞增殖的作用为活性检测指标，采用MTT法，测定了大鼠灌胃给予骨疏丹提取物后含药血清的活性，测得增殖率为45.1％。结果表明骨疏丹经机体吸收、代谢后对成骨细胞有一定的促进成骨样细胞UMR106增殖作用。 采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法同时测定大鼠组织样品中骨疏丹的活性成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、柚皮苷和蛇床子素的含量，考察给药骨疏丹后它们的组织分布情况。以卡马西平为内标，样品处理采用沉淀蛋白法。LC-MS/MS分析条件如下：色谱柱为ACOUITY UPLCTM BEHC<,18>，流动相为乙腈-0.1％醋酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.25mL·min<'-1>，柱温为40℃；质谱条件采用ESI源，正离子检测方式，多反应监测(MRM)。淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、柚皮苷和蛇床子素分别在20-400 ng·g<'-1>，20-400 ng·g<'-1>，100-2000ng·g<'-1>和10-1000 ng·g<'-1>范围内线性关系良好。结果表明淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ，柚皮苷，蛇床子素主要分布在胃、肠中，其次是肝、肾，在心、脾、肺、肾上腺、脑中未检测到各成分。 本研究在中医药学理论的指导下，将中药学、分析化学、细胞分子生物学和现代信息学等多学科技术相结合，建立了骨疏丹原料药材的高效液相指纹图谱，作为骨疏丹药材的质量控制方法之一，测定了骨疏丹含药血清体外药理活性指标，研究了骨疏丹在体内的分布特征，为复方骨疏丹的研究开发提供了一定的依据。

目录

第一章 前言

1.1中医药治疗骨质疏松症研究概况

1.2复方骨疏丹的研究概况

1.3指纹图谱在中药质量控制中的研究与应用

1.4血清药理学研究概况

1.5体内有效成分分析

1.6本文主要研究内容

第二章 骨疏丹原料药材高效液相指纹图谱研究

2.1仪器、试剂与材料

2.2骨碎补药材高效液相色谱指纹图谱分析

2.2.1色谱条件

2.2.2溶液的制备

2.2.3精密度试验

2.2.4稳定性试验

2.2.5重复性试验

2.2.6骨碎补指纹图谱测定

2.2.7骨碎补样品指纹图谱的相似度评价

2.2.8不同植物来源骨碎补的比较

2.3蛇床子药材高效液相色谱指纹图谱分析

2.3.1色普条件

2.3.2溶液的制备

2.3.3精密度试验

2.3.4稳定性试验

2.3.5重复性试验

2.3.6蛇床子指纹图谱测定

2.3.7蛇床子样品指纹图谱的相似度评价

2.4淫羊藿药材高效液相色谱指纹图谱分析

2.4.1色谱条件

2.4.2溶液的制备

2.4.3精密度试验

2.4.4稳定性试验

2.4.5重复性度验

2.4.6淫羊藿指纹图谱测定

2.4.7系统聚类分析

2.4.8淫羊藿样品指纹图谱的相似度评价

2.5讨论

第三章 骨疏丹含药血清促成骨样细胞增殖作用研究

3.1仪器、试剂与材料

3.2方法与结果

3.2.1样品制备

3.2.2给药方案及血清预处理

3.2.3试齐的配制

3.2.4吸光度与细胞数目的关系

3.2.5成骨样细胞UMR106的体外培养

3.2.6MTT法考察含药血清对成骨样细胞UMR106的增殖作用

3.2.7实验结果

3.3讨论

第四章 骨疏丹活性成分在大鼠体内的组织分布研究

4.1仪器、试剂与材料

4.2样品制备

4.2.1骨疏丹提取物制备

4.2.2组织样品采集

4.3液相色谱-串联质谱条件

4.3.2质谱条件

4.4分析方法确证

4.4.1方法的选择性

4.4.2标准曲线和线性范围

4.4.3定量下限

4.4.4方法的精密度和准确度

4.4.5回收率

4.4.6基质效应

4.5组织样品测定

4.6计论

第五章 结论

参考文献

附图

致谢

在读期间论文发表情况