利用重组工程技术构建多价DNA疫苗载体及大肠杆菌活菌疫苗载体的分析比较

摘要

疾病预防的有效途径之一是接种疫苗,继第一代减毒或无毒疫苗和第二代亚单位疫苗之后出现了第三代DNA疫苗。疫苗效果在很大程度上依赖于输送抗原的载体。为研究更有效的疫苗载体形式,本研究应用噬菌体Red重组酶介导的新型重组工程技术,构建了多价DNA疫苗载体前体及携带禽流感病毒抗原基因的多价DNA疫苗载体,为了更好的输送多价DNA疫苗,探索构建了具有哺乳动物上皮细胞黏附能力的无毒性重组大肠杆菌活菌疫苗菌株。
　　 在本室前期工作基础上,本实验应用如下Red重组工程系统及技术:①大肠杆菌染色体上Red重组系统及kan-sacB选择反选择筛选方法②pKD46重组系统及kan-kil选择反选择筛选方法③pYM-Red重组系统及Gap-Repair缺口修复技术,进行染色体上基因的无痕敲入、替换及质粒构建。本实验解决基因融合打靶问题时,在重组技术上有创新应用,利用Red重组酶工作原理,将外源片段体外重叠PCR法制备改为片段体内重组融合,片段融合及重组均在体内完成,省略了体外PCR的步骤加快实验进程。
　　 以pcDNA3.1(-)B为基础,以酶切连接方法构建了四价DNA疫苗载体pWYⅠ-Ⅱ-Ⅲ-Ⅳ,瞬时转染实验证明其具有蛋白表达能力,真核表达的多价DNA疫苗载体构建成功,可用于携带多价抗原基因,避免了多质粒操作带来的不便。然后利用重组技术试图将禽流感病毒基因组抗原基因HA头部、NA全长分别加载到其Ⅰ、Ⅱ位,构建二价DNA疫苗。
　　 将南美锥虫(trypanosome cruzi)gp82基因的P4及P8 DNA区段融合构建成P4/8基因片段,将其敲入大肠杆菌染色体的外膜蛋白LamB基因内形成融合蛋白,并展示在细胞外膜上,构建出带有细胞黏附能力的E.coli DY330 P4/8<>lamb菌株。通过体外黏附实验证明,以前构建的E.coli DY330 P4<>lamb比新构建的E.coli DY330 P4/8<>lamb菌株黏附哺乳动物上皮细胞的能力要强；同时体外细胞毒性实验证明DY330.P4<>lamb菌株安全性良好,可做为活菌疫苗载体的候选株进行深入研究。
　　 研究表明,重组工程技术在构建多种形式疫苗载体中具有灵活性及有效性,构建的多价DNA疫苗载体具备通用性,可以加载多种抗原基因的组合,作为快速制备疫苗的模板,有效应对突发疫情；构建的黏附性活菌疫苗载体可以携带DNA疫苗,也可以直接在染色体上携带抗原基因,高效运送抗原基因或蛋白。在应用中不断尝试各种构建方案也使我们更深入理解了重组酶工作原理,希望通过技术的拓展加速疫苗的研制与开发进程,为疾病的防治作出贡献。

目录

文摘

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第一章 绪论

1.1 意义

1.2 重组工程技术及应用简介

1.3 DNA疫苗简介

1.4 重组活菌疫苗载体

1.5 本论文研究内容

第二章 多价DNA疫苗载体的构建

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

2.3 小结

第三章 黏附性大肠杆菌活菌疫苗载体的构建及比较

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3 小结

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

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附录

致谢